1）模板量低或基因表达丰度低，可以增加模板量观察Ct值是否成相应倍数减少；2）qPCR整个反应条件不适宜或引物设计不当导致扩增效率低，可以通过标准曲线确认扩增效率；3）扩增产物过长，可以考虑用三步法程序扩增或优化引物，扩增产物长度不超过300 bp；4）体系中可能存在抑制剂影响酶的活性，可以考虑梯度稀释模板或重新制备纯度更高的模板。