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WB的目的蛋白条带与理论值不一样,可能的原因有以下几个:

如果排除实验操作问题的话,可能是因为细胞本身的蛋白表达量低,可以采用外源性过表达提高目的蛋白的表达量。

不是的。建议使用激光共聚焦显微镜来观察,将绿光和红光的细胞图像merge后,统计单个细胞内的红色荧光点数和黄色荧光点数,然后计算它们的比值即可反映自噬流的情况。

AAV应用时效果不理想的有关影响因素很多,从病毒本身到检测目的基因表达这些过程都有涉及,具体可以从以下几个方面来分析:

对照也检测到Flag标签可能有两个原因:一个可能是抗体的非特异性结合,导致出现非特异性条带,建议更换特异性较好的抗体;另一个可能是蛋白样品存在交叉污染,注意优化细胞培养、提蛋白及上样时

如果排除调控目的基因会致死的原因,这种情况很可能跟细胞状态有很大关系,即在感染前后细胞状态就已经下降,此时还未表现出大量死亡的现象,但一经消化传代后,细胞状态也在持续下降,导致可能出现有大量细胞飘起或不再贴壁。因此进行感染前要注意将细胞状态先调整好,例如适当提高血清浓度、定时换液等操作;或是选用状态好的细胞。

有的。分子伴侣介导自噬(CMA)的底物中均含有一个能被分子伴侣HSC70

CCK-8试剂盒不适合用于检测含有色素或颜色的样品,可能会影响检测结果;另外含有还原剂的样品在加入CCK-8

答案是可以的,但是有风险、有条件的。通过AAV利用Crispr/Cas9技术做在体敲除,理论上可以实现但实

遇到表达的荧光蛋白亮度较低时,我们可以考虑以下几个可能的因素:

① 荧光蛋白本身的亮度较低,换亮度高的即可;

荧光共振能量转移(FRET)是指被激发后的荧光蛋白供体将能量向其附近非激发状态的荧光蛋白受体转移,使受体蛋白被激发,并表现为

AAV血清型是针对病毒感染特性而言的,而特异性启动子的作用是在于病毒感染后的基因表达层面。通常所说的特异性启动子是指组织/细胞特异性启动子或器官特异性启动子,它是来源于只在某些特定组织或器官表达的基因的启动子,且该启动子的活性较好,在其特异性表达功能的加持下使得具有特异性血清型的AAV靶向表达更强。然而需要清楚的一点是,生物体内细胞表达调控非常复杂,实际应用过程中并非所有特异性启动子会都严格遵循表达特异性,在一定程度上讲可以定义为相对特异性。另外,动物的状态、注射方式、操作手法等都会影响AAV的感染效率。要是拿不准该怎么选择或者效果如何,建议先进行预实验摸索。



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