可以根据载体上是否具有嵌合5 ' LTR来区分第2或第3代穿梭载体。第二代穿梭质粒具有野生型5 ' LTR，需要Tat蛋白的存在才能发挥作用，而第三代穿梭质粒具有嵌合型5 ' LTR，包含CMV或RSV启动子以及部分5 ' LTR，包括嵌合的5 ' LTR消除了对HIV Tat蛋白的依赖，从而降低了在目的细胞中产生具有复制能力的慢病毒的概率。