有可能是冻存细胞的环节出现了问题：当细胞冷到零度以下时，细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶，冰晶的大小对细胞的影响是不同的，大冰晶容易造成细胞膜、细胞器的损伤和破裂，因此，会造成复苏出来的细胞存活率低、状态等与冻存前差异很大。我们在冻存细胞时需要有几点注意事项：

1）需冻存保种的细胞应生长状态良好且存活率高，其密度约在80%-90%，无污染。

2）冻存前注意切勿消化时间过长、吹打力度过重、离心转速过大或离心时间过长，以免造成细胞损伤。

3）细胞冻存原则为“慢冻”，因此，细胞加入冻存管后如何保存应严格遵守冻存流程，避免冻存太快，产生结晶。

4）程序降温盒和常规冻存液需室温备用，完全培养基、胰酶和PBS需37℃预热。