天然U6 snRNA的转录起始是G，所以一般建议U6启动子启动的转录序列以G作为起点。U6启动子启动shRNA和gRNA转录时，若G是目的序列的开头，则可以正常构建序列；若G不是目的序列的第一个碱基，则建议人为添加上。另外，如果没有特别想以G作为转录起始，则应使用A，而不要用C或T。但是，应注意的是，用G以外的碱基都会影响转录起始效率和位置。通常载体上使用的U6启动子是适用于哺乳动物的。