请问下，质粒也可以构建稳转株，为什么要用慢病毒做呢？

使用带有荧光标记的腺相关病毒（AAV）感染动物组织后，我做了组织石蜡切片，想通过荧光看下感染效率，可以直接观察吗？

我通过尾静脉注射AAV-F4/80感染小鼠心脏巨噬细胞，以在巨噬细胞中过表达目的基因，但取心脏组织做qPCR检测未看到目的基因的过表达是什么原因呢？

请问下，U6启动子启动转录序列的第一位必须是G吗？还有U6启动子的适用于哪些种属呢？

会有一定的影响，这个只能说在铺板的时候多吹吹，尽量把细胞吹开，尽量铺开

HepG2好像不太好做单克隆，要不就把sgrna设计在基因最前面几百bp，要不就做片段敲除，在基因左右两边设计sgrna，不过片段敲除的单克隆更难筛了。

肝脏本身是最容易被AAV感染的部位，可能是肌肉注射病毒进入循环系统了。

可以做一个药物梯度的预实验，如果每个浓度都出现细胞空泡，可能是细胞对puro比较敏感，病毒带荧光的话建议换成流式筛选。

可以检测病毒的元件或者是直接检测目的基因的dna，做QPCR检测

不一样的，VP指的是病毒颗粒数，包括了有感染能力的和无感染能力的，PFU测的是有感染能力的病毒数

我想请教一下miRNA的过表达可以用qPCR检测吗？miRNA序列太短了感觉不好设计引物。

腺相关病毒（AAV）感染小鼠成骨细胞，请问有没有合适的血清型或者启动子？

可能会比打成年小鼠影响大点，有些文章是50ul，试试25ul-50ul做个预实验就知道了。

特异启动子一般是二类启动子，这种启动子转录的RNA就会经历加工过程，不像U6那种3类RNA聚合酶专门转录短RNA，所有用2类启动子需要模拟miRNA的加工过程在shRNA上套个miRNA的加工框架，防止shRNA错误的表达

需要的，可以用RNA专用转染试剂，但是siRNA在体内维持时间很短，如果实验周期较长建议用病毒载体哦。

lncRNA 用慢病毒风险很大，慢病毒是RNA 病毒，lncRNA 的转录终止需要PolyA，而PolyA 会导致在包装过程中慢病毒基因组的表达提前终止，导致慢病毒包毒不成功。很多lncRNA 的PolyA 需要外加，自身不一定带。建议lncRNA 以DNA 病毒为载体，比如腺病毒和腺相关病毒。

用crispr-cas9技术做knock in实验，插入一个荧光标签蛋白，但最后去看混合克隆荧光的时候，都没有荧光，这要怎么办？

我购买了RNAFit转染试剂，在-20度放了一周还可以用吗？

我想同时敲低两个基因，可以把这两个基因的siRNA加到一个培养基里面吗？

大鼠尾静脉注射跟小鼠相比是不是更容易些？我要注射500ul AAV（腺相关病毒），有什么注意事项吗？

想做启动子转录因子双荧光素酶实验，去找合成公司给我合成启动子，那边说我这个片段很多段发卡结构、GC含量波动很大，合成很难。这可以优化序列吗？

我想筛稳转，之前摸过MOI在50，现在转crispr慢病毒（lintivirus, LV）跟gRNA慢病毒两个病毒的话是都加50还是都减半呀？

转染sirna的时候的时候我用FAM转染试剂摸浓度，最高的那个浓度转染效率有90%，要不要再扩大范围再摸一次浓度啊？

我用siRNA处理细胞，qpcr跑出来结果阴性对照NC组也有敲低效率咋办啊？

想用AAV（腺相关病毒）带特异性启动子来启动诱导细胞死亡的基因，杀死特定细胞，但我查到这个启动子在其他一些细胞上也会发挥作用，所以想用两个特异性启动子联合作用，请问这样可以达到实验目的吗？

做miRNA的过表达，想合成模拟物mimics序列来做，是不是合成目的基因的成熟体序列？还是前体序列也可以合成?

看看有没有收录人源的，一般转录因子的结合位点比较保守，所以也可以选择用人源的转录因子预测。或者是其他网站hTFtarget什么的也有结合位点预测功能。

稳转株可以稳定遗传的，没有固定的代数，构建好的稳转株用嘌呤霉素维持下就可以，直接在培养基中加一定浓度的嘌呤霉素，浓度一般是筛选浓度的一半。实验周期长的话，细胞最好2个月换一批新的。

可以用带转运肽的Gcamp6跟普通Gcamp6，分别带两种不同的荧光，这得转两个载体进去，腺病毒（adenovirus）感觉比较常用。

可以是可以，有文献用siRNA和质粒转染的，但是神经元细胞本身比较难转染，建议还是用病毒做。