尽管最初报道了具有截短的tracrRNA 3′末端的sgRNA，即sgRNA（+48），与使用crRNA和tracrRNA对22相比，在哺乳动物细胞中的基因靶向效果较差，但通过扩展其tracrRNA末端，优化了sgRNA结构。用于pSpCas9载体的sgRNA（+85）能够介导基因组修饰的最高效率。