小脑斧123
一个基因的多个转录本通常是以下一种原因或者几种原因共同导致：
（1）
目前主流的lncRNA敲除方法主要有三种：全基因座敲除、敲入poly（
干扰首先需要比对两个物种的基因的转录本序列，如果干扰的靶点完全互补，在物种基因组上是唯一的，干扰很可能是有效果的，可以去验证一下看看敲低效率；如果有一个以上的碱基是不同的，即便靶点是特异的，敲低效率会很低。
融合蛋白是将两个目的基因连在一起的，第一个基因的终止密码子需要去掉，为了最大程度的缓解两个蛋白之间的互相影响，通常会在两个蛋白之间加上
不是的，通过抗性筛选可以将为转染成功的细胞杀死，留下的都是转染成功的细胞。但转染成功的细胞并不意味着敲除成功，Cas9 对靶基因的编辑会导致
目前最常用的方法是利用crispr-cas9的技术进行基因的敲除，需要将cas9蛋白和gRNA递送到细胞核中。递送的方法有质粒法，病毒法和蛋白法
启动子：不同启动子诱导荧光蛋白表达的强弱不同，应选择广谱性或者组织特异性的强启动
子，如 EF1α、CAG 等。
表达方式（融合/非融合）：融合蛋白表达的荧光亮度通常低于单独的荧光蛋白，融合表达
时，荧光蛋白可能出现错误折叠等现象，导致检测不到荧光信号或荧光较弱。
连接元件：在同一启动子下的非融合表达一般用 2A 肽或 IRES 将目的基因和荧光基因 ORF
分隔开。
2A 连接的是一个启动子启动的编码一条蛋白链的两个蛋白，在 2A 肽的位置
激发波长/发射波长：对于单色实验，绿色荧光蛋白是最常用的，选择两种或以上荧光蛋白
进行多色成像时，建议激发和峰值发射波长均相隔 50-60nm 以上。荧光蛋白应用于活体成像实验时，尽量选择红色或近红外的荧光蛋白，这类荧光蛋白的发射波长较长，具有更好的
组织穿透能力。单体性质：将荧光蛋白与目标蛋白进行融合表达，直接地追踪目标蛋白或是定位目标蛋白，
多聚体可能会影响融合蛋白的生物学功能或定位，应尽量选择单体。
PK 值：每个荧光蛋白都有其最合适的 pH 值。大多数细胞器内及细胞质的 pH 值
需要考虑融合在 N 端或者 C 端，有的蛋白 N 端有信号肽（在蛋白转运后信号肽将被切除）、
N 端有甲硫氨酸切除，这类蛋白我们一般将标签构建在 C 端，或者构建在 N 端信号肽之后。
有的蛋白 C 端有折叠、活化时 C 端前肽被切除等，这类蛋白我们一般将标签构建在 N 端。
信号肽（signal peptide）：信号肽存在于靶向内质网的蛋白质中，最终蛋白可能是分泌型/
细胞外
siRNA、miRNA（mimics、inhibitor 等）上使用，一般用于确定转染效率，由于是化学发光不
可持续表达，易淬灭。
①转染时室内和超净台内不开日光灯(FAM 避光要求更严格)；
②转染操作要快，操作时间要短，操作完毕后，请尽快将培养板放到培养箱。
③转染后 4~6h 即可进行转染效率的检测。
（1）病毒液接触到皮肤时应脱掉污染的手套或者其他防护物，立即用含 75%乙醇消毒液
（或者 0.2-0.5%的过氧乙酸、500-10000 mg/L 有效氯消毒液、碘酒）的棉球擦拭，切不可用 84 消毒液，以免灼伤皮肤。并且用大量清水冲洗，至少 15 分钟。
（2）如果遇到针头扎伤或者刀片割伤时，第一时间处理伤口，应立即用力捏住受伤部位向
一个方向挤出伤口的血液，不可来回挤压，同时用流动水清洗伤口，至少 15 分钟。
（3）若病毒意外进入眼睛、口腔，立即用大
（1）病毒液接触到皮肤时应脱掉污染的手套或者其他防护物，立即用含 75%乙醇消毒液（或者 0.2-0.5%的过氧乙酸、500-10000 mg/L 有效氯消毒液、碘酒）的棉球擦拭，切不可
用 84 消毒液，以免灼伤皮肤。并且用大量清水冲洗，至少 15 分钟。
（2）如果遇到针头扎伤或者刀片割伤时，第一时间处理伤口，应立即用力捏住受伤部位向
一个方向挤出伤口的血液，不可来回挤压，同时用流动水清洗伤口，至少 15 分钟。
（3）若病毒意外进入眼睛、口腔，立即用大
1、病毒液溢出污染操作台：
（1）当有少量的病毒液体泼溅，立刻停止实验， 使用 84 消毒液擦拭操作台面。
（2）使用消毒剂时，从溢出区域的外围开始，朝向中心进行处理。作用适当时间后将所处
理物质清理掉。
（3）如果含有碎玻璃或其他锐器，则要使用镊子、簸箕或硬的厚纸板来收集处理过的物品，
并将它们置于可防刺透的容器中以待处理。切勿直接用手进行操作。
（4）对溢出区域再次清洁并消毒（如有必要，重复第 1~3 步）。将污染材料置于防漏、防
穿透的废弃物处理容器中。
2、病毒液溢出
1、病毒液溢出污染操作台：
（1）当有少量的病毒液体泼溅，立刻停止实验，用 75%酒精加 1%的 SDS 溶液擦拭操作台
面。
（2）使用消毒剂时，从溢出区域的外围开始，朝向中心进行处理。作用适当时间后将所处
理物质清理掉。
（3）如果含有碎玻璃或其他锐器，则要使用镊子、簸箕或硬的厚纸板来收集处理过的物品，
并将它们置于可防刺透的容器中以待处理。切勿直接用手进行操作。
（4）对溢出区域再次清洁并消毒（如有必要，重复第 1~3 步）。将污染材料置于防漏、防
穿透的废弃