小脑斧123

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最后活动于 28 天前

CircRNA是反向剪接形成的环装RNA,这种过程是可以人工模拟的,常见的过表达载体如质粒、慢病毒、腺病毒、

Cas9 滴度不高主要原因是基因太大了(cas9 有

一个基因的多个转录本通常是以下一种原因或者几种原因共同导致:

目前主流的lncRNA敲除方法主要有三种:全基因座敲除、敲入poly(

干扰首先需要比对两个物种的基因的转录本序列,如果干扰的靶点完全互补,在物种基因组上是唯一的,干扰很可能是有效果的,可以去验证一下看看敲低效率;如果有一个以上的碱基是不同的,即便靶点是特异的,敲低效率会很低。

融合蛋白是将两个目的基因连在一起的,第一个基因的终止密码子需要去掉,为了最大程度的缓解两个蛋白之间的互相影响,通常会在两个蛋白之间加上

不是的,通过抗性筛选可以将为转染成功的细胞杀死,留下的都是转染成功的细胞。但转染成功的细胞并不意味着敲除成功,Cas9 对靶基因的编辑会导致

目前最常用的方法是利用crispr-cas9的技术进行基因的敲除,需要将cas9蛋白和gRNA递送到细胞核中。递送的方法有质粒法,病毒法和蛋白法

启动子:不同启动子诱导荧光蛋白表达的强弱不同,应选择广谱性或者组织特异性的强启动
子,如 EF1α、CAG 等。
表达方式(融合/非融合):融合蛋白表达的荧光亮度通常低于单独的荧光蛋白,融合表达
时,荧光蛋白可能出现错误折叠等现象,导致检测不到荧光信号或荧光较弱。
连接元件:在同一启动子下的非融合表达一般用 2A 肽或 IRES 将目的基因和荧光基因 ORF
分隔开。
2A 连接的是一个启动子启动的编码一条蛋白链的两个蛋白,在 2A 肽的位置

激发波长/发射波长:对于单色实验,绿色荧光蛋白是最常用的,选择两种或以上荧光蛋白
进行多色成像时,建议激发和峰值发射波长均相隔 50-60nm 以上。荧光蛋白应用于活体成像实验时,尽量选择红色或近红外的荧光蛋白,这类荧光蛋白的发射波长较长,具有更好的
组织穿透能力。单体性质:将荧光蛋白与目标蛋白进行融合表达,直接地追踪目标蛋白或是定位目标蛋白,
多聚体可能会影响融合蛋白的生物学功能或定位,应尽量选择单体。
PK 值:每个荧光蛋白都有其最合适的 pH 值。大多数细胞器内及细胞质的 pH 值

需要考虑融合在 N 端或者 C 端,有的蛋白 N 端有信号肽(在蛋白转运后信号肽将被切除)、
N 端有甲硫氨酸切除,这类蛋白我们一般将标签构建在 C 端,或者构建在 N 端信号肽之后。
有的蛋白 C 端有折叠、活化时 C 端前肽被切除等,这类蛋白我们一般将标签构建在 N 端。
信号肽(signal peptide):信号肽存在于靶向内质网的蛋白质中,最终蛋白可能是分泌型/
细胞外

siRNA、miRNA(mimics、inhibitor 等)上使用,一般用于确定转染效率,由于是化学发光不
可持续表达,易淬灭。
①转染时室内和超净台内不开日光灯(FAM 避光要求更严格);
②转染操作要快,操作时间要短,操作完毕后,请尽快将培养板放到培养箱。
③转染后 4~6h 即可进行转染效率的检测。

(1)病毒液接触到皮肤时应脱掉污染的手套或者其他防护物,立即用含 75%乙醇消毒液
(或者 0.2-0.5%的过氧乙酸、500-10000 mg/L 有效氯消毒液、碘酒)的棉球擦拭,切不可用 84 消毒液,以免灼伤皮肤。并且用大量清水冲洗,至少 15 分钟。
(2)如果遇到针头扎伤或者刀片割伤时,第一时间处理伤口,应立即用力捏住受伤部位向
一个方向挤出伤口的血液,不可来回挤压,同时用流动水清洗伤口,至少 15 分钟。
(3)若病毒意外进入眼睛、口腔,立即用大

(1)病毒液接触到皮肤时应脱掉污染的手套或者其他防护物,立即用含 75%乙醇消毒液(或者 0.2-0.5%的过氧乙酸、500-10000 mg/L 有效氯消毒液、碘酒)的棉球擦拭,切不可
用 84 消毒液,以免灼伤皮肤。并且用大量清水冲洗,至少 15 分钟。
(2)如果遇到针头扎伤或者刀片割伤时,第一时间处理伤口,应立即用力捏住受伤部位向
一个方向挤出伤口的血液,不可来回挤压,同时用流动水清洗伤口,至少 15 分钟。
(3)若病毒意外进入眼睛、口腔,立即用大


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