小脑斧123

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最后活动于 3 天前

启动子:不同启动子诱导荧光蛋白表达的强弱不同,应选择广谱性或者组织特异性的强启动
子,如 EF1α、CAG 等。
表达方式(融合/非融合):融合蛋白表达的荧光亮度通常低于单独的荧光蛋白,融合表达
时,荧光蛋白可能出现错误折叠等现象,导致检测不到荧光信号或荧光较弱。
连接元件:在同一启动子下的非融合表达一般用 2A 肽或 IRES 将目的基因和荧光基因 ORF
分隔开。
2A 连接的是一个启动子启动的编码一条蛋白链的两个蛋白,在 2A 肽的位置

激发波长/发射波长:对于单色实验,绿色荧光蛋白是最常用的,选择两种或以上荧光蛋白
进行多色成像时,建议激发和峰值发射波长均相隔 50-60nm 以上。荧光蛋白应用于活体成像实验时,尽量选择红色或近红外的荧光蛋白,这类荧光蛋白的发射波长较长,具有更好的
组织穿透能力。单体性质:将荧光蛋白与目标蛋白进行融合表达,直接地追踪目标蛋白或是定位目标蛋白,
多聚体可能会影响融合蛋白的生物学功能或定位,应尽量选择单体。
PK 值:每个荧光蛋白都有其最合适的 pH 值。大多数细胞器内及细胞质的 pH 值

需要考虑融合在 N 端或者 C 端,有的蛋白 N 端有信号肽(在蛋白转运后信号肽将被切除)、
N 端有甲硫氨酸切除,这类蛋白我们一般将标签构建在 C 端,或者构建在 N 端信号肽之后。
有的蛋白 C 端有折叠、活化时 C 端前肽被切除等,这类蛋白我们一般将标签构建在 N 端。
信号肽(signal peptide):信号肽存在于靶向内质网的蛋白质中,最终蛋白可能是分泌型/
细胞外

siRNA、miRNA(mimics、inhibitor 等)上使用,一般用于确定转染效率,由于是化学发光不
可持续表达,易淬灭。
①转染时室内和超净台内不开日光灯(FAM 避光要求更严格);
②转染操作要快,操作时间要短,操作完毕后,请尽快将培养板放到培养箱。
③转染后 4~6h 即可进行转染效率的检测。

(1)病毒液接触到皮肤时应脱掉污染的手套或者其他防护物,立即用含 75%乙醇消毒液
(或者 0.2-0.5%的过氧乙酸、500-10000 mg/L 有效氯消毒液、碘酒)的棉球擦拭,切不可用 84 消毒液,以免灼伤皮肤。并且用大量清水冲洗,至少 15 分钟。
(2)如果遇到针头扎伤或者刀片割伤时,第一时间处理伤口,应立即用力捏住受伤部位向
一个方向挤出伤口的血液,不可来回挤压,同时用流动水清洗伤口,至少 15 分钟。
(3)若病毒意外进入眼睛、口腔,立即用大

(1)病毒液接触到皮肤时应脱掉污染的手套或者其他防护物,立即用含 75%乙醇消毒液(或者 0.2-0.5%的过氧乙酸、500-10000 mg/L 有效氯消毒液、碘酒)的棉球擦拭,切不可
用 84 消毒液,以免灼伤皮肤。并且用大量清水冲洗,至少 15 分钟。
(2)如果遇到针头扎伤或者刀片割伤时,第一时间处理伤口,应立即用力捏住受伤部位向
一个方向挤出伤口的血液,不可来回挤压,同时用流动水清洗伤口,至少 15 分钟。
(3)若病毒意外进入眼睛、口腔,立即用大

1、病毒液溢出污染操作台:
(1)当有少量的病毒液体泼溅,立刻停止实验, 使用 84 消毒液擦拭操作台面。
(2)使用消毒剂时,从溢出区域的外围开始,朝向中心进行处理。作用适当时间后将所处
理物质清理掉。
(3)如果含有碎玻璃或其他锐器,则要使用镊子、簸箕或硬的厚纸板来收集处理过的物品,
并将它们置于可防刺透的容器中以待处理。切勿直接用手进行操作。
(4)对溢出区域再次清洁并消毒(如有必要,重复第 1~3 步)。将污染材料置于防漏、防
穿透的废弃物处理容器中。
2、病毒液溢出

1、病毒液溢出污染操作台:
(1)当有少量的病毒液体泼溅,立刻停止实验,用 75%酒精加 1%的 SDS 溶液擦拭操作台
面。
(2)使用消毒剂时,从溢出区域的外围开始,朝向中心进行处理。作用适当时间后将所处
理物质清理掉。
(3)如果含有碎玻璃或其他锐器,则要使用镊子、簸箕或硬的厚纸板来收集处理过的物品,
并将它们置于可防刺透的容器中以待处理。切勿直接用手进行操作。
(4)对溢出区域再次清洁并消毒(如有必要,重复第 1~3 步)。将污染材料置于防漏、防
穿透的废弃

(1)病毒液接触到皮肤时应脱掉污染的手套或者其他防护物,立即用含 75%乙醇消毒液
(或者 0.2-0.5%的过氧乙酸、500-10000 mg/L 有效氯消毒液、碘酒)的棉球擦拭,切不可
用 84 消毒液,以免灼伤皮肤。并且用大量清水冲洗,至少 15 分钟。
(2)如果遇到针头扎伤或者刀片割伤时,第一时间处理伤口,应立即用力捏住受伤部位向
一个方向挤出伤口的血液,不可来回挤压,同时用流动水清洗伤口,至少 15 分钟。
(3)若病毒意外进入眼睛、口腔

1、病毒液溢出污染操作台:
(1)当有少量的病毒液体泼溅,立刻停止实验,使用 84 消毒液擦拭操作台面。
(2)使用消毒剂时,从溢出区域的外围开始,朝向中心进行处理。作用适当时间后将所处
理物质清理掉。
(3)如果含有碎玻璃或其他锐器,则要使用镊子、簸箕或硬的厚纸板来收集处理过的物品,
并将它们置于可防刺透的容器中以待处理。切勿直接用手进行操作。
(4)对溢出区域再次清洁并消毒(如有必要,重复第 1~3 步)。将污染材料置于防漏、防
穿透的废弃物处理容器中。
2、病毒液溢出污染离心机:

1、个人防护
(1)口罩最好用医用口罩。
(2)必须着长袖实验服,戴好帽子。
(3)防护服袖口塞到手套内。
(4)手套如出现破损,立即更换新的。
(5)脱掉手套前先消毒再摘除手套,随后用肥皂洗手。
(6)工作人员不能穿着工作服去实验室以外的地方。
2、操作环境
(1)尽量在生物安全柜或超净工作台(勿开通风)操作。
(2)若在实验室普通空间里操作,请选择气流稳定的空间。
3、病毒处理
(1)操作台面、仪器等使用 75%酒精或 1%的次氯酸钠溶液擦拭消毒。
(2)枪头、EP&n

根据中华人民共和国卫生部制定《人间传染的病原微生物名录》,慢病毒为第三类病原微生
物,能够引起人类或者动物疾病,但一般情况下对人、动物或者环境不构成严重危害,传播
风险有限,实验室感染后很少引起严重疾病,并且具备有效治疗和预防措施。

不同实验室保存的细胞特性有差异,操作者的实验手法也有所不同,我们推荐的是我们实验室常规的moi剂量,您这种情况可以降低moi试试

这个是不行的,敲低是 siRNA 序列与靶基因 mRNA 结合导致靶基因的整条 mRNA 降解从
而降低基因的表达;而敲除是对靶基因的基因组进行编辑,使之产生移码突变或者提前
出现终止密码子,从而导致不能翻译成正确的蛋白,这两种技术都是针对整个靶基因的
敲低或敲除的。
可以考虑把整个靶基因敲除掉,然后过表达某个结构域,但是有可能影响这个结构域的
结构和功能。

腺病毒感染离体细胞一般 36h 到表达高峰,可以持续表达四五天,之后就表达慢慢
减弱,直至在细胞内被完全降解。
在基因比较大,AAV 包装不下或者再需要注射后尽快表达的情况下,体内实验可以考
虑用腺病毒,尾静脉注射可以很好感染肝脏。其他组织用腺病毒必须要原位多点注射才
可以,而不能通过静脉注射感染其他脏器,静脉注射绝大部分都去感染肝脏了。
腺病毒在体内 3 天左右可以到达表达高峰,体内实验中,因为组织细胞一般都是终末
端分化的,而且体内细胞更新比较慢,所以可以维持 1-3 

人原代 T 细胞:人 T 专用慢病毒、悬浮细胞专用腺病毒(Ads)
鼠原代 T 细胞:逆转录病毒、悬浮细胞专用腺病毒
Jurkat 细胞(悬浮细胞):悬浮细胞专用腺病毒
T 细胞专用慢病毒和普通慢病毒报价一样,Ads 报价参考 APP-价格方案-腺病毒-悬浮细
胞用腺病毒报价

①病毒包装不成功;
②滴度不够;
③没感染上,被感染的细胞不同,其 MOI 值不同,要根据细胞类型适合调整加入的病毒
量;
④荧光只是观察病毒感染效果的一个辅助方式,荧光强弱不代表目的基因的表达量高低,
基因表达水平需要通过 qPCR 或者 WB 来鉴定。


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