可能的原因有，1.细胞冻存量过低，2.细胞降温速度欠佳，3.复苏时处理速度太慢，复苏过程不当

影响细胞生长因素有多种，可能是培养基有污染，胰蛋白酶消化过度，细胞传代次数过多，接种细胞起始浓度太低或太高等。

mKeima 所表达的Keima 蛋白定位于线粒体基质, 当线粒体自噬体与酸性溶酶体融合后Keima 蛋白的荧光信号由绿色转为红色，荧光信号的转换可定量反映线粒体自噬的发生发展，是研究线粒体自噬不可或缺的利器。

而mcherry-LC3标记自噬小体，用mito-mTurquoise2标记线粒体。mito-mTurquoise2线粒体特异性定位荧光探针（pHBdsred-mito）可准确标记定位线粒体，两者共转染细胞即可准确实时地追踪线粒体自噬的动态过程。

要设置两组对照

AAV 感染不会导致细胞病变效应，因此，空斑实验不能用于确定其感染滴度，而TCID50法一般需要利用腺病毒作为辅助病毒，另一方面，常用的活性颗粒检测方法需要在细胞中检测，AAV基因的表达需要较长时间，检测效率低。基因组滴度以AAV衣壳中所含基因组含量作为定量依据，测定的是含目标基因组的AAV浓度，方法简单高效。

滴度（Titer）：即单位体积中有感染能力的病毒数目。有几种不同的滴度的测定方法，各有适用范围。P24核心蛋白定量法，是比较经典的方法，简单重复性好，测定的是物理滴度。RNA基因组定量法，是测的物理滴度，精度高，但对仪器和操作的要求高。GFP荧光法，测定的是生物滴度，也是一种经典方法，简单重复性好。基因组DNA定量PCR的方法和荧光法是目前常用的慢病毒滴度检测方法。

一般是-80℃保存半年以上需要重新测量滴度。

荧光报告基因法检测慢病毒滴度相对比较简单，在感染病毒2天后荧光显微镜，因为加入的病毒是稀释过的，通过计算出来的数值再乘以稀释倍数即可。而慢病毒载体如果没有荧光报告基因，只有抗性筛选标记的话，可以用抗生素筛选来测定滴度。这个方法筛选稳转株时间相对比较久一点。

可以通过细胞形态等观察

这个需要具体分析，gRNA序列是否设计在CDS上，已经敲除株中是否还有CAS9及gRNA。

达到全身感染比较难的，可以尝试用光普型血清型AAV9，和广普型启动子CMV启动子，通过尾静脉注射方式进行感染。