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最后活动于 25 天前

可能的原因有,1.细胞冻存量过低,2.细胞降温速度欠佳,3.复苏时处理速度太慢,复苏过程不当

影响细胞生长因素有多种,可能是培养基有污染,胰蛋白酶消化过度,细胞传代次数过多,接种细胞起始浓度太低或太高等。

mKeima 所表达的Keima 蛋白定位于线粒体基质, 当线粒体自噬体与酸性溶酶体融合后Keima 蛋白的荧光信号由绿色转为红色,荧光信号的转换可定量反映线粒体自噬的发生发展,是研究线粒体自噬不可或缺的利器。

而mcherry-LC3标记自噬小体,用mito-mTurquoise2标记线粒体。mito-mTurquoise2线粒体特异性定位荧光探针(pHBdsred-mito)可准确标记定位线粒体,两者共转染细胞即可准确实时地追踪线粒体自噬的动态过程。


AAV 感染不会导致细胞病变效应,因此,空斑实验不能用于确定其感染滴度,而TCID50法一般需要利用腺病毒作为辅助病毒,另一方面,常用的活性颗粒检测方法需要在细胞中检测,AAV基因的表达需要较长时间,检测效率低。基因组滴度以AAV衣壳中所含基因组含量作为定量依据,测定的是含目标基因组的AAV浓度,方法简单高效。

滴度(Titer):即单位体积中有感染能力的病毒数目。有几种不同的滴度的测定方法,各有适用范围。P24核心蛋白定量法,是比较经典的方法,简单重复性好,测定的是物理滴度。RNA基因组定量法,是测的物理滴度,精度高,但对仪器和操作的要求高。GFP荧光法,测定的是生物滴度,也是一种经典方法,简单重复性好。基因组DNA定量PCR的方法和荧光法是目前常用的慢病毒滴度检测方法。

一般是-80℃保存半年以上需要重新测量滴度。

荧光报告基因法检测慢病毒滴度相对比较简单,在感染病毒2天后荧光显微镜,因为加入的病毒是稀释过的,通过计算出来的数值再乘以稀释倍数即可。而慢病毒载体如果没有荧光报告基因,只有抗性筛选标记的话,可以用抗生素筛选来测定滴度。这个方法筛选稳转株时间相对比较久一点。


donor质粒同源臂载体不必带启动子,不需要表达,带启动子也没有

这个需要具体分析,gRNA序列是否设计在CDS上,已经敲除株中是否还有CAS9及gRNA。

达到全身感染比较难的,可以尝试用光普型血清型AAV9,和广普型启动子CMV启动子,通过尾静脉注射方式进行感染。


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