为了使sgRNA在U6启动子下有效转录，G优选位于5′位置，其对应于20bp引导序列的第一个碱基。对于不以G开头的引导序列，建议在引导序列的5′上添加一个额外的G，产生一个21 bp的引导序列（5′-GNNNNNNNNnnNNNNNN-NNNNNNNN-3′，其中20个N对应于5′-NGGPAM上游的20 bp基因组靶序列）。添加5′G不会改变sgRNA的特异性或影响Cas9切割的效率。