一般要注意以下5个方面：

1、评分：在线网站预测评分较高的

2、靶点序列：避免出现连续4个及以上的T；如果用U6或T7启动子驱动sgRNA的表达载体，需要考虑sgRNA的5'碱基是否为G或GG。

3、CG含量：一般在40%~60%之间较好。

4、靶点位置：需要设计在CDS区；要在独立外显子上，尽量靠近蛋白N段，一般是在编码区前1/3的位置；多个靶点之间序列不重叠，避免snp影响靶点有效性。

5、特异性：默认针对同源区设计，在基因组其他位置，至少出现错配3个碱基。