下一班

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最后活动于 2023-10-26

体外实验特异性启动子的特异性倾向不太行,建议从细胞提取培养分离入手,把目的细胞分离出来做实验。

血清中含有大量的蛋白质,在转染过程中,带负电的蛋白质可能干扰阳离子脂质体/阳离子聚合物对核酸的吸附,影响转染效率。

内毒素高的话会的。一般 <50EU/µg 可以用于转染细胞,基本上对细胞没有影响。

同时打的话病毒量可能有点大,小鼠不一定承受的了,可以两个AAV各注射50μl,一周后重复注射一次。

Mimics可以用qPCR验证,但是miRNA inhibitor、antagomir以及miRNA干扰封闭等不适用,因为封闭是与miRNA发生结合从而抑制miRNA,并非改变miRNA的生成及降解,检测效果可以通过检测靶基因的表达水平进行验证。

高滴度的AAV可以考虑减量注射,在实验过程中稀释病毒产品的等渗溶液没有其他特殊要求,常规的动物试验用等渗溶液即可,如 PBS、生理盐水等。稀释后的样品尽量一次用完,在 2~8℃ 保存时间越短越好。

可以的,混合起来转染就可以了,加起来总共是多少量就按照那个浓度加对应量的转染试剂。不过提前摸一下转染试剂的细胞毒性,转染试剂加多了可能对细胞状态有影响。

实验中用到的假病毒即重组aav现在普遍不认为整合进基因组,频率很低。野生型的aav有研究过可能会整合到染色体的某个特定部位。

可以的,慢病毒穿梭质粒理论上是可以直接在真核细胞里表达的,搭配gRNA质粒验证即可。

两种预测方法都只能作为参考,具体还是要做实验,也有targetscan预测分数很低但实验结果显示有结合的情况。然后做实验还是以targetscan给出的结合位点或者种子区为准。

一般通过在设计干扰序列对应的目的转录本的编码区CDS位置进行氨基酸同义突变即可不受干扰序列的影响,完成回补实验。

这原因很多了,转录后mRNA的剪接修饰和稳定性,或者调控因子比如miRNA的调控等等,都会影响翻译效率,从而影响蛋白的表达水平。总之,这个实验结果挺常见的。

不建议这么做,因为感染细胞的来源、状态以及病毒的生产过程对细胞感染病毒的MOI都有较大的影响。有条件的话,建议每拿到一株病毒都要做一次MOI摸索实验,以确定最好的感染效率。

融合表达后目的序列+荧光标记表达一个蛋白,荧光蛋白可以指示目的蛋白在细胞中的表达位置;非融合表达目的蛋白和荧光蛋白分开表达或表达后断裂成两个蛋白,最终是两个独立的蛋白。


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