橘子

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最后活动于 6 天前

我做敲低,mRNA有降低,为何蛋白的抑制没有mRNA那么明显呢?甚至有时候遇到mrna降低很明显,蛋白却没有降低。

我做敲低,siRNA下调效果很好,但是包装成shRNA病毒后,下调效果变差了,这是为什么呢?

目的基因融合荧光,会因为担心融合荧光影响目的蛋白功能在目的基因和荧光中间加一个linker吗?

慢病毒做的敲低稳转细胞株的复苏传代操作和正常细胞有什么区别吗?

基本原则是内参基因被准确检测,同时不干扰报告基因的表达,可以选择活性较低的TK启动子驱动的内参基因载体,报告基因质粒和内参基因质粒比例在10:1到100:1之间比较常见,但也可能会超出这个比例,建议进行预实验摸索一下最适比例。

石蜡切片需要做免疫荧光,荧光二抗尽可能避开病毒带的荧光颜色,做冰冻切片可以直接观察荧光。

背景很高的原因主要是组织太干,一方面可能是由于在多聚甲醛中浸泡的时间太久,另一方面可能是由于切片后组织晾的太干燥。明亮的亮点可能是PBS没有过滤就用来洗片子,里面有杂质,或者是镜头上面的杂质,有些亮点可能也与组织本身的结构有关。

可以,但不建议,因为AAV体外实验表达水平较低,一方面是由于rAAV病毒的基因组是单链DNA,在体外环境形成双链并转录翻译外源基因的效率非常低。另一方面,AAV对细胞毒性低,体外的细胞加入AAV病毒后,对细胞的分裂生长能力影响不大,因而随着细胞的分裂,对于AAV载体是一种稀释作用,这也导致其在细胞实验中的表达效率不高。并且AAV感染细胞时需要很高的moi,通常moi需要大于10^4才能检测到外源基因的表达,达到10^5~10^6才能获得理想的表达效果。

我用嘌呤霉素(puromycin)摸索细胞适合的浓度,但是用到10ug/ml的浓度48小时仍杀不死空白细胞是什么原因呢?

一个启动子启动两个基因表达时,T2A连接和IRES连接有什么区别?

我有2个目的片段要连到载体上,可以直接用无缝克隆试剂盒来做吗?

慢病毒(lentivirus, LV)使用完就需要放-80℃吗?

同一个基因在不同细胞中的信号通路传导、基因表达水平、生理特性上存在差别,导致siRNA的转染效率、对靶基因的降解能力、降解后细胞功能和状态存在差异,在实验结果上就表现出siRNA的敲低水平不同。

一般情况下,被污染的细胞应立即丢弃,并对细胞间的器材试剂等进行杀菌消毒处理,但若是珍贵细胞,不舍得丢掉,首先要辨别污染类型,再采取相应的措施:
细菌污染比较容易发现和辨别,细胞培养基在6-8h后呈现混浊,有时稍加震荡,便会有很多混浊物漂起,显微镜下观察呈黑色细沙状,或背景有大量黑点,对于细菌污染,联合使用青霉素、链霉素等抗生素能有效防治。
真菌污染最短3天才能长出椭圆形的霉斑,霉斑往往会漂浮在培养液表面,随着时间逐步扩大,有些真菌呈类似棉花絮状的漂浮物,若是念珠菌会呈卵圆状,在细胞周边生长。真菌污染时细胞培养液一般不会变浑浊,但在显微镜下可观察到菌丝体。真菌污染可以使用抗

首先需要是能稳定传代的细胞系,原代细胞传代次数有限,一般不用来构建稳转株;其次要考虑细胞和插入片段的兼容性,部分稳转株筛选后会出现插入片段丢失的现象,建议在进行正式筛选前进行预实验或挑选单克隆细胞株避免类似的问题发生。

如果是自己包装的慢病毒,可能是病毒纯度不够或者有支原体污染等,但是公司包装的慢病毒有成熟的纯化工艺,一般不会出现这种情况;如果是敏感细胞,MOI过高也会出现状态变差的现象,需要在正式实验前摸索最适MOI,并且及时换液;最后也可能和目的基因有关,研究的基因与生命周期活动有关,对这个基因过表达或者干扰之后影响了细胞状态。

Puro抗性和氨苄抗性是一回事吗?


纯化腺病毒注射动物后多久表达呀?如果我的实验周期1个月,注射1次可以吗?


我用PURO抗性的慢病毒感染细胞表达后,用嘌呤霉素筛选了感染阳性的细胞,那后续培养还需要加嘌呤霉素吗?


我想把miRNA过表达的mimics和另外一个我的质粒一起转染细胞,这个有什么方案吗?


我常用的有两种方法:一种是通过真核细胞抗性药物筛选,例如puro;一种是让细胞带上荧光信号,利用流式细胞仪分选得到荧光信号阳性的细胞。

建议选择生物发光Luc,GFP和RFP等背景太高,灵敏度低,因此不是很推荐。

(1)病毒包装不成功。
(2)滴度不够。
(3)被感染的细胞不同,其MOI值不同,要根据细胞类型适当调整加入的病毒量。
(4)荧光只是观察病毒感染效果的一个辅助方式,荧光强弱不代表目的基因的表达量高低,基因表达水平需要通过基因表达水平需要通过qPCR或者WB来鉴定。

抗支原体:抑制按照1:1000的比例加到培养基中,预防按1:2000比例加;黑胶虫:按照1:500比例加到培养基中;两个可以同时加。

我用病毒转染细胞之后到底多长时间换液啊?


如果我用T2A或IRES连接2个基因进行过表达,比如 基因A—T2A/IRES—基因B,那么我前面的 基因A 需要加终止密码子吗?


Flag/6His/Myc等蛋白标签一般带在蛋白的N端还是C端呀?


我用慢病毒感染我的目的细胞进行基因过表达,qpcr检测目的组相对于对照组上调上万倍,这正常吗?


lncRNA是长链非编码RNA,转录出来的RNA并不会翻译成蛋白质。2A肽是在蛋白水平实现基因的分隔表达,所以不能用于此种载体设计。IRES可在RNA水平实现基因分隔表达,但是转录出来的RNA是荧光蛋白序列、IRES和lncRNA序列的融合,荧光蛋白和IRES序列可能会严重影响lncRNA功能,所以也不建议使用。一般都会选择双启动子载体,分别启动荧光及lncRNA。

感染全脑我觉得可以考虑用跨血脑屏障血清型BBB的腺相关病毒(Adeno-associated virus,AAV)进行尾静脉注射;如果要感染全脑小胶质细胞我觉得可以考虑用跨血脑屏障血清型BBB并结合小胶质细胞特异性


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