siRNA和shRNA的作用机制不同。siRNA是直接化学合成的双链小干扰RNA，通常在细胞质中聚集，直接与目的基因靶点结合，因此干扰效率较高。shRNA通常需要质粒或病毒载体导入靶细胞的细胞核内。根据驱动表达的启动子的不同，shRNA可被RNA聚合酶II或者III催化转录。在转运到细胞质之前，这些初始的前体结构需要首先被加工形成pre-shRNA。pre-shRNA随后被酶切，去除发卡结构，产生在3‘末端带有两个游离碱基的21-23nt的双链siRNA，siRNA与目的基因靶点结合，这个过程可能因为拷贝数低，转录过程复杂导致干扰效果不佳。