小分子蛋白做WB总是很难出结果,有什么需要注意的地方吗?

小分子蛋白做WB总是很难出结果,有什么需要注意的地方吗?

By 梧桐树下 at 2023-02-15
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1 个回复 | 最后更新于 2023-02-15
vegfaaaaaaa
2023-02-15
#1

分子量越小的蛋白条带越易呈现出向四周弥散的趋势,甚至看不到条带了,其原因是分子量越小的蛋白所能结合到的SDS也就越少,在电场作用下,蛋白向前迁移过程中会向四周弥散。解决方法如下:

(1) 一般20kd以下的蛋白,电泳选择15%以上的胶,或者用梯度胶。

(2) 增加浓缩胶比例,使蛋白样品在分离前充分压平,对蛋白分离有一定的帮助。

(3) 缩短电泳的距离,可以减少蛋白迁移过程的弥散程度,但需要确保目的蛋白和内参区分开。

(4) 电泳过程中注意降温,温度升高会加快小蛋白分子的运动,增加弥散速度。

(5) 转膜液不要加SDS,要加10-20%的甲醇;甲醇的作用有两方面:一是将小分子蛋白上的SDS洗脱,带的负电荷减少,减慢移动速度,能有效防止其穿透PVDF膜;二是可以帮助转到膜上的蛋白固定在膜上,使其不易脱落。

(6) 转膜一定要选择0.22μmPVDF膜,17kd以下的蛋白基本会穿透0.45μm的膜;当穿透严重时,可以用两张0.22μm膜叠加使用。

(7) 还可以减少转膜时间,降低转膜的电压电流,200mA-250mA15-30min差不多就可以了。


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