菌落PCR用的什么引物？是基因特异引物还是载体上的引物，载体酶切后是切胶回收的还是直接连接的？基因特异引物的话可能是模板污染（比如气溶胶），用载体引物有可能是存在未切开的载体，建议用一个基因的正向特异引物加一个载体反向引物来菌落PCR检测阳性克隆。