小分子蛋白做WB总是很难出结果，有什么需要注意的地方吗？

分子量越小的蛋白条带越易呈现出向四周弥散的趋势，甚至看不到条带了，其原因是分子量越小的蛋白所能结合到的SDS也就越少，在电场作用下，蛋白向前迁移过程中会向四周弥散。解决方法如下：

（1） 一般20kd以下的蛋白，电泳选择15%以上的胶，或者用梯度胶。

（2） 增加浓缩胶比例，使蛋白样品在分离前充分压平，对蛋白分离有一定的帮助。

（3） 缩短电泳的距离，可以减少蛋白迁移过程的弥散程度，但需要确保目的蛋白和内参区分开。

（4） 电泳过程中注意降温，温度升高会加快小蛋白分子的运动，增加弥散速度。

（5） 转膜液不要加SDS，要加10-20%的甲醇；甲醇的作用有两方面：一是将小分子蛋白上的SDS洗脱，带的负电荷减少，减慢移动速度，能有效防止其穿透PVDF膜；二是可以帮助转到膜上的蛋白固定在膜上，使其不易脱落。

（6） 转膜一定要选择0.22μm的PVDF膜，17kd以下的蛋白基本会穿透0.45μm的膜；当穿透严重时，可以用两张0.22μm膜叠加使用。

（7） 还可以减少转膜时间，降低转膜的电压电流，200mA-250mA转15-30min差不多就可以了。