分子互作干货1-免疫沉淀（IP）技术详解

在蛋白质相关研究中，传统分离技术如：电泳、色谱和沉淀法等提供了蛋白质的初步分离手段，其中电泳主要根据蛋白质的大小进行分离，但难以区分分子量相近的蛋白质；亲和色谱则依赖特定配体，且需要特定条件。传统分离技术在分辨率和特异性上存在局限，这些技术限制推动了科学家寻找更精确的识别和分离方法，因此，免疫沉淀（Immunoprecipitation，IP）技术应运而生，并成为了现代生物医学研究中不可或缺的蛋白研究工具。

IP是一种利用特异性抗体结合抗原，并通过沉淀富集的方式从复杂的样本中分离出目标蛋白的方法。最初，IP技术是作为亲和柱色谱的一种改进方法而开发的，在微量离心管中使用少量的琼脂糖树脂完成。随着技术的进步，磁性微粒（磁珠）逐渐取代了琼脂糖，成为IP的首选支持物，提高了IP的纯度和可重复性。另外，自20世纪70年代单克隆抗体技术发展以来，全面提升了抗原-抗体结合的特异性和灵敏度，使得IP在蛋白互作等领域发挥着越来越重要的作用。更重要的是，根据检测目的的不同，IP的发展催生了免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，Co-IP）、染色质免疫共沉淀（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）和RNA免疫共沉淀（RNA Binding Protein Immunoprecipitation，RIP）等衍生技术，能够有效反映活细胞内蛋白与蛋白、蛋白与其他生物分子间的生理性相互作用。

图1. IP及其衍生技术示意图

Co-IP：用于检测两种或两种以上蛋白质之间的相互作用。通过使用针对不同蛋白质的抗体，Co-IP可以揭示蛋白质复合体的组成成分，是研究信号传导和细胞调控网络的有力工具。

ChIP：专注于研究蛋白质与DNA的相互作用，尤其是转录因子或组蛋白修饰与特定基因启动子区域的结合。ChIP实验结合了IP和DNA测序（ChIP-Seq）技术，极大地推进了表观遗传学和转录调控领域的研究进展。

RIP：用于研究RNA分子与蛋白质的相互作用，如RNA结合蛋白（RBPs）与目标RNA的结合。RIP技术有助于理解RNA加工、运输、稳定性以及RNA介导的基因调控机制。

下面，我们首先从IP实验技术开始为大家进行详细的介绍，Co-IP、ChIP以及RIP的知识分享将在后续的推文中分期为大家一一介绍。

免疫沉淀（IP）实验

IP用于从复杂的生物样本中分离和纯化特定蛋白质，依赖于抗体对目标蛋白的特异性识别并形成抗原-抗体复合物，然后通过物理方法（如离心或磁珠）将这些复合物沉淀下来，再结合Western blot（WB）或质谱（mass spectrum，MS）对目标蛋白进行检测分析，即可对目标蛋白进行定性/定量分析。接下来，我们从IP实验目的、IP实验原理、IP实验步骤、IP实验结果解读和IP优缺点及常见问题分析等方面对于IP实验技术进行具体解析。

1、IP主要实验目的

（1）鉴定特定蛋白的存在和表达水平；

（2）研究蛋白的翻译后修饰，如磷酸化、甲基化等；

（3）确定蛋白复合物的形成；

（4）纯化目的蛋白以进行进一步的分析。

2、IP实验原理

将含有目的蛋白的样品溶液与特异性抗体结合，该抗体的Fc片段又能结合到protein A/G上，protein A/G（结合了protein A和protein B的IgG结合结构域，具有与IgG的Fc片段特异性结合的能力，可用于抗体的亲和纯化。）通常会固定在琼脂糖颗粒或磁珠上，进而吸附目的蛋白，后续再通过离心收集、洗脱、溶解等步骤分离获得目的蛋白。抗体可以预先固定在固相支持物（琼脂糖或磁珠上）；也可以先是游离状态时与目的蛋白结合后再结合到固相支持物上，回收抗原-抗体复合物。

图2. 预固定抗体（A）和游离抗体（B）进行免疫沉淀的示意图

3、IP实验步骤

（1）收集细胞于离心管中，4 ℃以500 g离心5 min，弃上清；使用预冷的1×PBS洗涤细胞1-2次，同时离心去除上清；

（2）加入500 μL含蛋白酶抑制剂的IP裂解/洗涤缓冲液于冰上裂解细胞30 min；

（3）将裂解液于4 ℃以10000 g离心30 min，取上清；

（4）预留少量上清液（约10-20 μL）用于WB实验，作为Input样本；

（5）将2-10 μg的抗体（具体参考抗体说明书）与剩余的上清液混合，在4 ℃摇床孵育1 h或过夜，以形成抗原-抗体复合物；

（6）根据试剂说明书制备protein A/G-beads，将抗原-抗体复合物与50 μL的protein A/G-beads混合，4 ℃摇床孵育1-4 h，4 ℃以3000 g离心5 min收集沉淀，小心弃去上清；

（7）用500 μL裂解缓冲液洗涤protein A/G-beads 3-4次，每次洗涤后需离心；

（8）根据相应的洗脱方法，使用50 μL洗脱缓冲液洗脱抗原-抗体复合物，得到目的蛋白；

（9）对目的蛋白进行WB检测或MS分析。

4、IP实验结果解读

（1）IP-WB：

图3展示了IP后的WB检测结果示意图，解读结果前先认识一下各标注的含义：

Input：指阳性对照，使用预留的细胞裂解液进行WB，以确认目的蛋白的存在，排除假阳性结果的干扰。

IP：指用对应的抗体来富集目的蛋白，例如IP中的a是指用了蛋白a的IP抗体去富集样本中的蛋白a。

WB：用来检测样本中目的蛋白的存在与否，例如WB中的a是指用蛋白a的抗体去检测样本中的蛋白a是否存在。

IgG：用于做IP的阴性对照。

图3. IP实验结果参考示意图

根据标注含义分析，结果A和结果B是代表两种不同的结果。这两个结果的Input组都检测到了蛋白a和蛋白b，说明样本中含有这两种蛋白。结果A中，通过蛋白a的抗体进行IP可以靶向蛋白a的同时也沉淀下了蛋白b，表明蛋白a和蛋白b间存在相互作用。反之，结果B的IP样本中没有检测到蛋白b，即说明二者不存在互作。（需要注意的是，IP所检测到的相互作用不能反映是直接作用还是间接作用，研究具体作用机制需要进一步分析检测。）

（2）IP-MS：

IP-MS可以进一步定量分析蛋白的丰度和鉴定蛋白间的相互作用。

① 在定量分析中，关键指标包括Fold Change和Intensity，Fold Change表示实验组与对照组间蛋白丰度的差异倍数，Intensity则反映蛋白质的相对丰度。根据实际情况设定合理的Fold Change阈值和P值，进而评估蛋白表达差异和统计学显著性。

② 在蛋白互作分析中，重点关注Intensity数值较大且Fold Change较高的蛋白，提示它们可能与目标蛋白有显著的相互作用。同时，需要警惕可能的非特异性结合，特别是当某蛋白的Fold Change和Intensity高于靶蛋白时。

图4. IP-MS火山图示例^[1]

5、IP优缺点及常见问题解析

IP的优点在于其特异性高、应用范围广、能反映蛋白间的生理性相互作用，以及可与WB和质谱等技术联用，进行深入的蛋白质分析。然而，IP也存在一些局限性，包括可能出现的非特异性结合、依赖于高质量抗体、以及实验操作熟练度等。因此在实际的实验操作过程中，大家可能会遇到一些常见的实验问题，小恒整理了相关问题及对应的解决方案供大家参考：

实验问题1：WB显色结果有大范围的深色背景：

可能原因：封闭不充分；一抗的浓度过高或是孵育时间过长；洗膜不充分；抗体特异性不佳；显色时间较长。

解决方案：孵一抗前可4℃封闭过夜；将一抗稀释至适合的浓度，还可适当缩短抗体孵育时间；抗体孵育后充分洗膜；更换特异性更好的抗体。

实验问题2：免疫沉淀下来的蛋白量较少：

可能原因：目的蛋白丰度低；抗体亲和力不足。

解决方案：若是蛋白本底表达量低，可以考虑将目的基因构建到质粒或病毒载体上进行外源性过表达，若目的蛋白没有合适的抗体，还可以通过融合表达标签蛋白（如3*flag、HA等），借助标签蛋白的抗体进行免疫沉淀；另一方面，可以调整IP的加样顺序，即蛋白丰度低时采用抗原和抗体先结合，再加入磁珠孵育，能更好地富集目的蛋白。抗体方面，需重新更换、测试、评估新抗体的亲和性和特异性。

实验问题3：出现假阳性或假阴性结果：

可能原因：抗体与非特异性蛋白交叉反应导致的假阳性；目的蛋白未被沉淀或裂解过程中被降解，导致假阴性。

解决方案：设置合理的对照。例如对于假阳性，可使用非特异性的IgG抗体作对照；对于假阴性，可充分裂解细胞，操作过程中使用蛋白酶抑制剂以防止蛋白降解等。

实验问题4：IP样本洗脱后未检测到目的蛋白：

可能原因：洗脱条件不适宜；目的蛋白在该细胞中本底表达量低？

解决方案：可使用多种洗脱缓冲液进行比较，找到最合适的洗脱条件。一般可分为变性洗脱和非变性洗脱。变性洗脱是用SDS-PAGE上样缓冲液使蛋白变性，可有效解离抗原-抗体的亲和作用，方便后续做WB检测。如果后续需要进行功能性分析，则需要使用非变性的酸性洗脱法（0.1M甘氨酸，pH2.5-3），可解离大多数抗原-抗体互作的同时保留目的蛋白的活性。

实验问题5：Input中无条带但IP中有；或者相反Input中有条带，而IP中没有：

可能原因：Input中无条带但IP中有可能是目的蛋白丰度低，WB的一抗不够灵敏，而经IP富集后可检测到；另一种情况则可能是IP所用的抗体是识别蛋白内部的线性表位，而不是构象表位，导致无法捕获目的蛋白。

解决方案：第一种情况可以选择灵敏度更高的抗体，或通过外源性过表达来提高目的蛋白的丰度；对于第二种情况，在兼顾抗体特异性的同时，选择适用于IP的抗体是关键。

综上，本文介绍了IP技术及其在生物医学研究中的应用，包括实验目的、实验原理、实验步骤、实验结果解读和常见问题分析及解决方案。IP技术有助于分离和分析特定蛋白质，为深入理解蛋白质功能提供了重要工具。那么如果需要研究更为复杂的蛋白互作网络，Co-IP则是更适合的方法，下期我们将继续介绍Co-IP实验的相关内容，欢迎大家持续关注~

参考文献

[1] Demirdizen E, Al-Ali R, Narayanan A, et al. TRIM67 drives tumorigenesis in oligodendrogliomas through Rho GTPase-dependent membrane blebbing. Neuro Oncol. 2023;25(6):1031-1043. doi:10.1093/neuonc/noac233.