Chemical Engineering Journal IF= 15.1丨SARS-CoV-2等RNA病毒防治的新视角

严重急性呼吸综合征冠状病毒2型（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）自 2020 年初爆发以来，在全球迅速传播，引发了大流行，导致大量感染和死亡。世界各地的科学家正在努力更好地了解 SARS-CoV-2 的传播机制、病理特征、诊断工具和治疗方法。一些有效的治疗和预防措施，包括抗病毒药物和血浆疗法，已经诞生。然而，仍然需要更多的研究来探索 SARS-CoV-2 的生物学特性以防治其危害。研究发现SARS-CoV-2 非结构蛋白 nsp12、nsp7和nsp8可形成多亚基复制/转录复合物。其中，nsp7 和 nsp8 协助增强nsp12的模板结合和 RNA 合成能力。nsp12又称 SARS-CoV-2 RdRp，是核心催化亚基，对病毒复制和传播至关重要。nsp12也是SARS-CoV-2 中最保守的蛋白质之一，且有研究表明nsp12可抑制宿主 I 型干扰素 (IFN-I) 反应，因此，nsp12 也是SARS-CoV-2的一个有希望的治疗靶点。

2023年8月16日，西安交通大学第一附属医院杨琪团队在《Chemical Engineering Journal》上在线发表了题为“Lung-targeted delivery of nsp12 siRNAs restores host type I interferon responses”的研究论文，设计了特异性靶向SARS-CoV-2 nsp12 的 siRNA，并通过一系列体外和体内实验建立了一种肺靶向系统，利用RBD-11b 修饰的阳离子脂质体将nsp12 siRNAs（nsp12 siRNAs@RBD-11b-CLs）递送至小鼠肺中。结果发现其可高效抑制小鼠肺中外源性nsp12的表达，并显著恢复宿主的 I 型干扰素反应。这项研究将为SARS-CoV-2和其他 RNA 病毒的治疗提供新的视角和方法。值得注意的是，在本研究中，作者使用了汉恒生物提供的纯化腺病毒产品在小鼠肺部进行nsp12基因过表达。

接下来，让我们一起来了解一下这篇文章吧。

nsp12对SARS-CoV-2 基因组复制、转录和病毒包装过程至关重要，此外，nsp12 还能调节 IRF3- IFN-I 介导的宿主细胞抗病毒反应。因此，用 siRNA 靶向宿主细胞中的 nsp12 将阻断 SARS-CoV-2 的 RNA 合成和转录，恢复宿主细胞中 IFN-I 通路的正常激活。

图1. nsp12 siRNAs@RBD-11b-CLs功能示意图

首先，作者进行了nsp12 siRNA的体外筛选实验。将nsp12基因的RdRp结构域（366至920氨基酸残基）与荧光素酶基因融合构建到质粒上。随后，构建了过表达nsp12 (RdRp)-luciferase的HEK293T细胞，用于筛选特异性靶向nsp12的siRNA。为了敲低宿主细胞中的 nsp12，作者合成了三组 nsp12 siRNA，即 nsp12 siRNA-1、-2 和 -3，以及一组非靶向的阴性对照siNC。将这些 siRNA 转染到表达nsp12 (RdRp)-luciferase的 HEK293T 细胞中。结果显示，nsp12 siRNA-1、-2 和 -3 显著降低了 HEK293T 细胞中 nsp12 的 mRNA 水平和蛋白水平，并抑制了荧光素酶的活性。这些结果表明这些nsp12 siRNA可抑制nsp12 的表达。

图2. nsp12 siRNA的筛选

人血管紧张素转换酶 2 (ACE2) 是病毒进入时 SARS-CoV 和 SARS-CoV2 的功能性受体，广泛表达于多种人体细胞表面，尤其是肺和肾细胞。来自SARS-CoV受体结合域 (RBD) 的肽 RBD-11b (YKYRYL) 已被证明对 SARS-CoV 与宿主细胞 ACE2 受体的结合起着关键重要。因此，利用这种肽可能是实现肺靶向药物输送的有效策略。

作者分析了ACE2与RBD-11b的结合位点，发现该位点在人和小鼠中具有同源性。为了验证是否可以利用RBD-11b实现非靶向药物递送，作者构建了高表达小鼠ACE2-mCherry融合蛋白的HEK293T细胞株，合成RBD-11b标记的脂质体，并负载上荧光染料Dio，将其命名为RBD-11b-lipo-Dio。与RBD-11b-Lio-Dio（15μL脂质体，含约100μM RBD-11b和50μg/mL Dio）孵育1.5小时后，表达小鼠ACE2的细胞吞噬脂质体，从而显示出绿色荧光信号，而对照组几乎没有绿色荧光信号。这一发现表明小鼠 ACE2 对 RBD-11b 多肽的敏感性与人类 ACE2 完全相同。为了验证RBD-11b与小鼠ACE2相互作用的序列特异性，作者分别合成了在RBD-11b的第二、第三和第四个氨基酸处突变的肽（YAYRYL、YKARYL 和 YKYAYL）。分别用等量的对照脂质体（lipo-Dio ）、RBD-11b-lipo-Dio 和用三种突变肽修饰的脂质体处理表达小鼠 ACE2 的 HEK293T 细胞1.5小时。结果发现，对照脂质体未被细胞吸收，而RBD-11b-lipo-Dio则被细胞大量吸收。这表明RBD-11b 促进了表达小鼠 ACE2 的细胞更早、更强地吸收脂质体，证实了 RBD-11b 与小鼠 ACE2 的靶向结合。而三种突变多肽组则阻碍了RBD-11b 介导脂质体的内吞作用，表明了 RBD-11b与小鼠 ACE2的结合具有特异性。

图3. RBD-11b 特异性靶向小鼠 ACE2

DOTAP (1,2-二油酰-3-三甲基铵-丙烷)是一种阳离子脂质试剂（CL)，常用作细胞膜透过性增强剂、基因递送载体或药物递送系统的一种组分，其已被证明适合用于肺部药物输送，将其与中性脂质体结合可能是递送 siRNA 的最佳选择。因此，作者准备使用 RBD-11b 标记的 CL 来实现更好的肺靶向递送 nsp12 siRNA。用 Cy5 荧光标记 nsp12 siRNA 的 5′ 端，然后将其装载到 CL 中。电子显微镜下，肺靶向脂质体（siRNA-Cy5@RBD-11b-CLs）和非靶向对照脂质体（siRNA-Cy5@CLs）均为球形，大小均匀，表面光滑。动态光散射测量显示siRNA-Cy5@CLs和siRNA-Cy5@RBD-11b-CLs的粒径分别为110±27nm和114±33nm，多分散性指数（PDI）<0.2，表明脂质体对于静脉或腹腔使用是安全的。将100ul siRNA-脂质体复合物经尾静脉注射小鼠体内后，原位和体外成像均表明RBD-11b-CLs能有效地将siRNA-Cy5递送至小鼠肺部，而siRNA-Cy5@CLs则几乎完全在肝脏中富集。进一步研究表明，siRNA-Cy5@RBD-11b-CLs处理的小鼠肺中Cy5荧光强度明显高于siRNA-Cy5@CLs处理小鼠。这些结果表明RBD-11b-CLs能高效地将siRNA递送至小鼠肺部。

图4. nsp12 siRNAs@RBD-11b-CLs的表征及肺靶向性

为了模拟小鼠肺细胞中nsp12的表达，作者将过表达nsp12-luciferase的腺病毒（Adv-nsp12），通过气管插管方式递送到小鼠肺部，然后通过发光成像监测不同时间点的荧光素酶表达情况。结果显示，在病毒注射后第2天至第6天，小鼠肺中均可检测到腺病毒介导的荧光素酶活性。与第二天相比，第6天和第8天肺中的发光强度明显降低。在病毒注射后第4天和第8天处死小鼠，然后对胸腹部器官进行发光检测。结果显示，在病毒注射后第4天，小鼠肺显示出强的发光信号，但在第8天信号消失。基于以上发现，作者从Adv-nsp12给药第2 天起，每天对小鼠进行三次nsp12 siRNAs@RBD-11b-CLs静脉注射（每只小鼠每天注射每种nsp12 siRNA 2.5 nmol），以PBS或 siNC@RBD-11b-CLs（每只小鼠每天 7.5 nmol siRNA）注射作为对照。在第4天结束时，通过发光成像评估nsp12-luciferase的表达情况。结果发现PBS 和 siNC@RBD-11b-CLs 未能改变肺中荧光素酶的表达，nsp12 siRNAs@RBD-11b-CLs 显著抑制了荧光素酶的表达。与对照小鼠相比，nsp12 siRNAs@RBD-11b-CLs 处理的小鼠的肺组织中 nsp12 的表达受到显著抑制。对不同器官进行免疫组化染色，均未发现nsp12 siRNAs@RBD-11b-CLs中各器官有明显损伤，表明siRNAs@RBD-11b-CLs在具有靶向抑制小鼠肺部nsp12表达的同时，还具有良好的生物安全性。

图5. siRNAs@RBD-11b-CLs在体内可抑制外源性nsp12表达

有研究表明，SARS-CoV-2 的 nsp12 通过阻止 IRF3 核易位显著阻断 IFN-I 反应。为此，作者试图确定 nsp12 siRNA 对 Adv-nsp12 感染肺细胞中 IFN-I 活性的影响。通过 IHC 分析IRF3 的亚细胞定位，发现在用 PBS 和 siNC@RBD-11b-CLs 处理的小鼠肺泡细胞中 IRF3 主要在细胞质中表达而不是在细胞核中表达，而在 nsp12 siRNAs@RBD-11b-CLs 处理的细胞中更多的 IRF3 进入细胞核。由于IRF3 是 IFNβ 的有效转录因子，作者又通过 RT-qPCR 和 ELISA 测定检测了 nsp12 siRNAs@RBD-11b-CLs 处理的小鼠和 PBS 或 siNC@RBD-11b-CLs 处理的小鼠肺组织中 IFNβ 的表达情况。结果与对照小鼠相比，无论是mRNA水平还是蛋白水平，nsp12 siRNAs@RBD-11b-CLs 显著提高了小鼠肺中 IFNβ 的表达。 接下来，作者又研究了 nsp12 敲低对干扰素刺激基因 (ISG) 表达的影响。PKR 是一种典型的 ISG，在病毒感染的上皮细胞中表达，通过抑制蛋白质合成来阻止病毒颗粒的形成。RT-qPCR 和免疫荧光试验均表明，与对照组相比，nsp12 敲低显著促进了 Adv-nsp12 感染肺中 PKR 的表达。这些数据表明了nsp12 siRNAs@RBD-11b-CLs 介导的小鼠肺中 nsp12 敲低可以通过恢复 IFN-I 反应有效激活宿主的抗病毒免疫。

图6. Nsp12 siRNAs@RBD-11b-CLs 重新激活宿主的 IFN-I 反应

综上所述，本研究筛选并鉴定了有效抑制nsp12的siRNA。并且RBD-11b 标记的 CL 可以高效特异性地将 nsp12 siRNA 递送到小鼠肺部，从而抑制 nsp12 的外源表达。此外，通过这种策略抑制 nsp12 可以显著恢复宿主的 IFN-I 反应。这项研究将为 RNA 病毒（包括 SARS-CoV-2）的预防和管理提供新的视角和新的研究方向。