这是固定的作用（1）迅速防止细胞死亡后的变化,防止自溶、腐败，尽量保持生长状态结构。（2）使细胞中的蛋白质、脂肪、糖、酶等成分转变为不溶性物质，以保持生前的形态。（3）使组织内各种物质成分产生不同的折光率，便于观察和鉴定。（4）使不同组织成分对染料有不同的亲和力，便于染色。（5）防止细胞过度收缩或膨胀，失去原有的形态结构 。如果不固定，你可能会错过一些生命现象

如果jaspar有这个转录因子 的数据能预测位点 ，是可以通过双荧光素酶检验的。

AAV 载体在体外实验中用于转导培养细胞时，常发现其表达水平较低，而且有表达延迟现象。这是因为 AAV 基因组是单链的，它进入细胞以后，必须要有一个由单链变为双链的过程，然后其所携带的外源基因才能进行转录和翻译，在没有辅助病毒或其它辅助因子的情况下，这种 AAV 由单链 DNA 在细胞内复制形成双链 DNA 的过程是十分缓慢的，因此相对于其它双链 DNA 病毒载体如单纯疱疹病毒（HSV）和腺病毒（Ad），其表达明显延后。此外，AAV 对细胞毒性低，培养的细胞在加入 

病毒载体在细胞试验中要想取得满意的结果，主要在以下几个方面：①病毒载体在不同的细胞由于细胞表面受体的差异而不同转导效率不同，尽量选择转导效率高的细胞，可用参考文献报道和转导报告基因进行筛选。②良好的细胞状态。③最好在细胞状态最佳时感染病毒。特别是不要在消化细胞后不久就感染，因为此时细胞膜上的病毒受体往往受到了暂时的破坏，应该培养过夜后再感染病毒，效果较好。④适当的感染 MOI（病毒数/细胞的比），⑤适当的感染体积，如 24 孔板可用 200ul，6 孔板 0.5ml。⑥适当的感染时间。⑦可加合适辅助药物刺激，如慢病毒感染可以加&nbs

Gene-GFP 融合慢病毒感染细胞后荧光比较弱，可能是哪些因素造成的？

什么是干扰 NC 对照？什么是乱序对照？

siRNA 和 shRNA 有什么区别呀？

细胞和动物水平的基因过表达或者干扰一般用什么病毒比较合适呢？

进行一个基因的过表达，添加 flag 标签的目的是什么呢？

我想做小鼠活体成像，可以用荧光蛋白来做吗？

慢病毒（lentivirus, LV）、腺病毒（adenovirus, AD）、腺相关病毒（adeno-associated virus, AAV）都可以进行再次扩增吗？

为什么不能用质粒来构建基因稳定表达细胞株呀？

高滴度的 AAV 可以考虑减量注射 ，如果没有其他特殊要求，常规的动物试验用等渗溶液即可，如 PBS、生理盐水等。稀释后的样品尽量一次用完，在 2～8℃保存时间越短越好。

质粒：一般转染之后QPCR 24-48 小时检测，WB需要48h-72h，一般可以稳定表达 3-4 天。SiRNA: 一般转染之后QPCR 24-48小时检测，WB需要48h-72h，维持时间 3-4 天 。

mir 与靶基因预测，比较常见的是针对这个基因的 3’utr 区域进行预测的，在 NCBI找到对应基因 3’utr 序列，比如targetscan能预测结合位点，也可以手动找下与miRNA种子序列互补的mRNA序列，一般是 7碱基 结合位点为比较理想的结合形式。

可以通过ATCC网站查询细胞的培养方法，网站https://www.atcc.org/products/htb-133。

Mimics（双链）：模拟生物体内源的 miRNAs，运用化学合成的方法合成，能增强内源性miRNA的功能。 Inhibitor（单链）：化学修饰的专门针对细胞中特异的靶miRNA的抑制剂。 Agomir（双链）：化学合成的，在mimics基础上，经过特殊化学修饰（反义链进行修饰，3’端进行胆固醇修饰，5’端两个硫代骨架修饰，3’端四个硫代骨架修饰，全链甲氧基修饰）的升级产品，更稳定，不需要转染试剂，可直接溶解后用于动物实验。 Antagomir（单链）：是经过特殊化学修饰（3’端进行胆固醇修饰，5’端两个硫代骨架修饰，3&rsquo

不一定有效果的，想要这样做的话：首先，需要看大鼠干扰靶点序列是否与小鼠基因 CDS 序列完全匹配，不能完全匹配则干扰效果不佳或者无效果；其次，要确定在小鼠基因的特异性，否则在小鼠中可能会有脱靶效应。 

是先构建cas9-grna质粒，然后转工具细胞（细胞里没有这个基因的话，先转一个过表达质粒），转染后72h左右（至少48h），将细胞提取DNA，然后用基因的引物扩增基因（扩大概500bp左右），扩出的片段再用T7E1酶切，看酶切出的条带，如果切开的两个条带越亮，说明酶切活性越好；还要进行测序，主要以测序结果为准。引物设计是尽量选靶序列前后距离不一样的，酶切出的条带不一样才好能区分。

一般为了筛选到稳定表达待研究基因的细胞株，确定杀死未转染细胞的最低浓度嘌呤霉素至关重要。所以初次做实验的时候一定要建立适合自己体系的杀死曲线( kill curve )： (1) 96孔板内以5-8x 10^3 cells/孔的密度铺板，铺足够量的孔以进行后续的梯度实验，细胞孵育过夜； (2) 准备筛选培养基-含不同浓度嘌呤霉素的新鲜培养基(如0-10μ g/mL，至少5 个梯度)； (3) 细胞孵育过夜后加入筛选培养基，孵育细胞； (4) 约2-3天更换新鲜的筛选培养基； (5) 每日监测细胞观察存活细胞比例。嘌呤霉素的最佳作用时间一般在1-3天之间； (6) 最小的抗生素使用浓度就是

萤火虫荧光素酶Fluc和海肾荧光素酶Rluc与底物反应后，检测波长分别是多少呢？

针对基因编码区CDS设计的干扰序列进行慢病毒包装后做细胞基因干扰，后续进行基因的过表达回补实验要怎么做呀？

慢病毒感染细胞，使用抗性（比如嘌呤霉素puro）筛选后，后续培养细胞需要继续使用抗性维持培养吗？

QPCR 实验中 Ct 值偏大（如 Ct 值＞30）是为什么？

过表达和干扰的启动子有什么区别？

用表达gRNA和cas9的质粒做瞬时转染可以达到基因稳定敲除的目的吗？

腺相关病毒（adeno-associated virus，AAV）在体注射感染动物，一般多久开始表达呀，可以维持表达多长时间呢？

Tet-on的慢病毒（lentivirus, LV）感染细胞，一般四环素（doxycycline）加进去多久后开始起效呢？

OPC ，PAGE ，HPLC代表三种不同的纯化方式，纯度不一样，一般 OPC在65%以上，PAGE在80%以上，HPLC在85%以上。纯度越高越好，一般普通的细胞实验OPC足够了，做动物实验至少要PAGE级别以上。

一般多放在蛋白的 C 端，蛋白的N端属于头部，C端是尾部，蛋白的N会带有蛋白的分选信号，比如信号肽，因此为了不影响蛋白的分布，更推荐标签放在蛋白的C端。