细胞封片要不要甲醛固定

如何预测转录因子的结合位点，我这边已经用chip确定了一个小范围

AAV 在细胞上的表达远比不上在动物体内的表达，为什么？

影响病毒转染效果的因素有哪些？

质粒转染细胞进行基因表达，其整合是非同源重组随机整合，几率非常低，且这些转染条 件下发生的整合多发生在转录非活跃区或者重复序列区，导致外源片段表达效率低，同时 这些整合常常不稳定，随着传代次数的增加，即使在有压力选择的情况下也容易发生丢失。

不是所有的都能再次扩增，只有腺病毒可以用293A细胞进行再次扩增，而慢病毒、腺相关病毒都需要进行再次包装，不能进行直接扩增。

对于带3FLAG标签的蛋白用 Flag 抗体进行蛋白免疫印迹（western blot，WB）检测时，结果会是一条外源表达的条带；如果用目的抗体去检测，结果可能会是两个条带（内源蛋白+外源过表达蛋白），外源过表达条带在内源条带的上方，但是很多时候两条带会在一起形成一条比较粗的条带。

活体成像技术（optical in vivo imaging）目前主要采用生物发光（bioluminescence）与荧光（fluorescence）两种方法。原理：生物发光法是基于荧光素酶能催化底物化学发光的原理，将荧光素酶底物荧光素如 D-Luciferin 等注射入体内进行化学发光反应。荧光发光是通过激发光激发荧光基团到达高能量状态，而后产生发射光，如 EGFP，RFP等。但是由于生物体自发荧光干扰和荧光穿透问题，所以 GFP 等荧光蛋白适合做皮下等浅层组织的活体成像。目前，95%以上的活体实验都是采用荧光素酶 lucifera

蛋白标签（protein tag）是指利用 DNA 体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白质，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和纯化等。比较常用的Flag标签，一般用3FLAG（分子量 2.64kd，一个氨基酸的平均分子量是 0.110KDa）的比较多，主要是方便在 WB 检测表达情况时可以用 Flag抗体去检测外源蛋白过表达的情况，也可以方便的用于蛋白免疫沉淀实验（Immunoprecipitation, IP）。

T47D细胞培养条件我应该去哪里找?

micRNA 与靶基因预测是怎样来做的？

质粒和siRNA一般转染后多久见效，效果维持多久？

AAV需要稀释，用什么稀释后注射动物？

仍旧需要使用抗性进行维持培养的，维持培养可以将抗性浓度减半（相对于筛选时的浓度）

1）第一个可能是模板量低或基因表达丰度低，建议增加模板量观察Ct 值能否成相应倍数减少。2）第二个可能是 qPCR 整个反应条件不适宜或引物设计不当导致扩增效率低，建议通过标准曲线确认扩增效率。3）第三个可能是扩增产物过长，建议用三步法程序扩增或通过优化引物，扩增产物长度最好不超过 300bp。4）第四个可能是体系中存在抑制剂影响酶的活性，建议梯度稀释模板或重新制备纯度更高的模板。

fluc萤火虫荧光素酶与底物反应后的检测波长是在560nm左右，rluc海肾荧光素酶与底物反应后的检测波长在460nm左右。

后续进行基因过表达回补的话，一般就是在目的基因编码区CDS中针对干扰序列对应的位置进行同义突变再进行回补；如果干扰序列设计在非翻译区（5UTR或3UTR）则过表达回补就不用考虑做同义突变啦，直接过表达野生型编码区CDS序列即可。

大鼠的siRNA，同一个基因可不可以用于干扰小鼠？

Mimics、inhibitor跟agomir、antagomir区别？

sgrna活性怎么验证？

puro浓度预实验是怎么做的？

这个结合我的经验一般AAV是注射后2周是表达起峰，3周高表达，4周稳定表达；一般在体表达维持时间是3-6个月，也要结合组织的代谢情况具体分析的，实验周期长的话，一般会在一个半月到两个月复注射一次

一般四环素加进去就可以起效，检测RNA或者蛋白表达的话我一般是加入四环素后48-72h检测表达的。

过表达用的是 II 型启动子，是依赖 II 型 RNA 聚合酶的启动子，可以启动长的片段，比如 CMV、EF1A ，依赖 PolyA 进行转录终止；干扰用的是 III 型启动子，是依赖Ⅲ型 RNA 聚合酶的启动子，比如 U6，H1启动子，聚合酶Ⅲ遇到连续 4 个或 5 个 T 时,它指导的转录就会终止。

可以这样做的，cas9和gRNA表达后会对基因组进行编辑，基因组被编辑后就是稳定存在的，之后可以进行单克隆培养，筛选基因敲除单克隆

OPC ，PAGE ，HPLC 三种纯化方式的siRNA或者 mimic 有什么区别，一般怎么选择？

在蛋白上添加FLAG等蛋白标签一般带在蛋白的N端还是C端？

miRNA与靶基因的双荧光素验证能不能在研究的细胞中进行？

EGFP/mCherry 能不能用于活体成像

不需要的，只要用对照病毒摸索出这个细胞合适的MOI就行，我一般用96孔板摸索，节省病毒。