1）启动子强弱
A. 过表达用的是 III 型启动子，是依赖 III 型 RNA 聚合酶的启动子，可以启
动长的片段，比如 CMV、EF1A 依赖 PolyA 进行转录终止。
B. 干扰用的是 II 型启动子，是依赖 II 型 RNA 聚合酶的启动子，比如 U6，H1
启动子，聚合酶Ⅲ遇到连续 4 个或 5 个 T&nb

融合蛋白是直接把两个目的基因连在一起的，第一个基因的终止密码子需要去掉， 如果可
以，还可以加上 GGGGS 柔性 linker，也可以直接连一起，我们一般直接连一起做的比较多。
T2A 连接的是一个启动子启动两个蛋白，在 2A 肽的位置会断裂开来。既然是一条蛋白链，
那肯定不能有终止密码子的，要去掉第一个基因的终止密码子加上 2A 肽序列再加上第二个
基因即可。
IRES 是核糖体进入位点，作为额外的核糖体募集位点起作用，允许翻译起始发生，在除了

这种情况首先需要比对两个物种的基因核苷酸序列以及碱基序列，如果一致，则过表达与干
扰都可以通用；但如果碱基序列不一致，但同源性极高，就可以比对一下蛋白序列。如果蛋
白序列一致，做过表达是可以的，但是干扰就需要分别设计了，如果两者的碱基数就不一致，那就过表达与干扰都是要分开做的。

不是的，通过抗性筛选可以将为转染成功的细胞杀死，留下的都是转染成功的细胞。
Cas9 对靶基因的编辑会产生几种不同的情况：indel（基因序列发生的插入或缺失改变）。
Indel 又有 3 倍数碱基和非 3 倍数的，前者造成的结果是氨基酸的插入或缺失，这种情况编
辑位点前后的氨基酸序列不变，不认为是一个成功的敲除。后者造成移码突变，编辑位点后
的氨基酸序列发生紊乱，这种是成功的敲除，翻译出来的代表序列会被降解掉，在混合细胞
中这几种情况同时存在，即使在同一个细胞中，大部分细胞也是这几种情况

编码基因依靠3联密码子来编码蛋白，最终通过蛋白序列来表现基因功能，在做敲除的时候，某一个点的改变就可以导致这个序列翻译出来蛋白序列发生改变，即移码突变，这样的突变就可以导致蛋白功能的丧失。但是非编码基因是以RNA的形式作用，某个位置的点突变或indel发生后很难使其丧失功能，除非这个突变位点是该序列发生作用的唯一位点（这种情况概率极小，相当于是基因组的定点突变），所以非编码的敲除需要在两端各设计一个sgRNA。

两种方式：分别为antago与sponge，两种方式都是通过利用microRNA的互补序列对microRNA的功能进行封闭。 
Antago只有一条mir的互补序列，而sponge一般为四条mir的互补序列串在一起，对microRNA 的封闭效果更好。一般推荐选 sponge方式。

当然是需要的，不同物种间的两个miRNA可能是一样的序列，也有可能完全不一样，同样靶基因的序列也是，可能同源性很高，也可能差别很大，都是需要通过预测，并进行实验验证来确认的。MiRNA与靶基因，启动子与转录因子双荧光素酶验证实验出现阴性的结果，这是很正常的现象，因为前面的预测是根据一定的算法得出来的结果，只是一种可能性，是否真正的就有作用，是需要实验来验证的。

（1）调整细胞状态，感染时使用对数期的细胞
（2）延长感染时间。一般慢病毒感染时间是24h，对于生长比较快速的细胞，感染时间可适当延长到24-48h。多次重复感染，也可显著提高感染效率
（3）对于polybrene耐受的细胞，可加polybrene助转剂，一般工作浓度为4-8ug/ml 
（4）减少病毒感染时的液体面积，离心感染。可以用平角离心机，具体步骤可参照我们的病毒操作手册，尤其适用于悬浮细胞的感染，对于贴壁细胞也有增强感染效果的作用。 
（5）对于T细胞等难感染的细胞，用专用的病毒，比如T细胞专用慢病毒，T 细胞专用逆

我们以前做过MOI是100左右，建议你做实验的时候还是先自己预实验看下，用96孔板，做MOI梯度的预实验，找荧光效率超过80%的最低MOI。

AAV 载体在体外实验中用于感染细胞时，常发现其表达水平较低，而且有表达延迟现象。这是因为AAV基因组是单链DNA的，它进入细胞以后，必须要有一个由单链变为双链的过程，然后其所携带的外源基因才能进行转录和翻译，在没有辅助病毒或其它辅助因子的情况下，这种 AAV 由单链 DNA 在细胞内复制形成双链 DNA 的过程是十分缓慢的，因此相对于其它双链DNA 病毒载体如单纯疱疹病毒（HSV）和腺病毒（Ad），其表达明显延后。此外，AAV 对细胞毒性低，培养的细胞在加入 AAV 后，细胞分

Flag 包括 8 个氨基酸，24 个碱基，3flag 是 72 个碱基，分子量 2~3KD。我们公司 Flag是加在 C 末端。
His6 是 6 个组氨酸残基组成的融合标签，分子量小，只有~0.84KD，可插入在目的蛋白的 C末端或 N 末端,一般不影响目标蛋白的功能。
GST(谷胱甘肽巯基转移酶) 标签蛋白，天然大小为 26KD，GST 融合表达系统广泛应用于各种融合蛋

1. LncRNA 大部分是定位于细胞核内，RNAi 机制在细胞质效率远高于细胞核；
2. LncRNA 是具有高度二级结构的 RNA，可能影响 siRNA 与 lncRNA 的结合；
3. LncRNA 与 DNA 及蛋白形成复合体，同样阻碍 RISC 复合体与 lncRNA 的结合效率；
4. LncRNA 在多种类型细胞或模型中表达丰度低，可能会影响干扰效果的判