腺相关病毒（Adeno-associated virus, AAV）感染肝细胞的话，需要用什么浓度，大概可以维持表达多长时间呢？

慢病毒（lentivirus , LV）感染细胞时，细胞接种量是多少比较好呢？

慢病毒（lentivirus , LV）如何稀释？

首先， 性质差异； 转染是带有目的基因的质粒 DNA 在转染试剂作用下强行进入细胞的过程， 而感染是慢病毒颗粒和目的细胞相互作用， 通过受体结合、 细胞吞噬等过程， 介导慢病毒基因组进入到细胞中；其次， 表达环节不同； 转染的 DNA 进入细胞后， 转录为 mRNA， 之后就可以翻译了；而慢病毒是 RNA 逆转录病毒， 感染细胞后， 先逆转录为 DNA， 再转录为 mRNA， 然后才是翻译 

SaCas9 来自金黄色葡萄球菌， 基因长度由经典的 spCas9 的 4400bp 缩短为 3300bp。SaCas9 识别的 PAM 区为 NNGRRT（NNGAAT,NNGAGT,NNGGAT,NNGGGT） ， NNGRRN。 ， 对于 sgRNA的长度， 一般应为 21 或者 22bp， SpCas9 识别的 PAM 区为 NGG， 对于 sgRNA 的长度， 一般应为 20bp.慢病毒和腺病毒用的是 SpCas9， 腺相关病毒用的是 SaCas9。

一般是以下原因：（ 1） 常规原因， 包括病毒滴度、 细胞感染难易程度等（ 2） 目的基因大小， GFP 蛋白水平的表达会受到目的基因的大小而变化， 通常接入的基因越大， GFP 荧光越弱（ 3） 目的基因的功能的影响 GFP 的表达。 对于核定位、 膜定位、 分泌类的蛋白与 GFP融合表达， GFP 观察荧光时会受到目的蛋白的功能的影响； 通常在同等基因大小条件下， 无定位趋势的目的基因和GFP 融合蛋白的荧光强度要远高与具有定位趋势的基因的表达。 

可能是显微镜的汞灯使用时间长导致，可以通过对照排除，若对照较亮可以排除显微镜的问题；培养基的PH值低，看培养基是否发黄，PH值较低会导致绿色荧光淬灭；目的基因插入到病毒载体后，荧光强度是会相对较弱一些，可以增加曝光时间。

siRNA 是化学合成的，不需要经过剪切就可以直接跟靶点结合进行作用的，效率比较高； shRNA 是一个构建到质粒上或者包成病毒，需要转录形成发夹结构的 shRNA，经过酶切，才 能跟靶点结合，这个过程可能因为拷贝数低，转录过程复杂导致干扰效果不理想。

这种情况有挺多可能的，比如：1、两种抗体灵敏度；2、过表达量被本底掩盖，基因在细胞本身有较高的内源性表达量，过表达后检测到的浓度之比本底的高一点，所以并不明显，此时如果上样量再有点差异就会被掩盖，而标签抗体是有或者无的区别，因此较明显；3、这个基因存在多个转录本，目的抗体只能检测其中某一种或某几种表达形式，可以查看一下抗体的抗原表位或者咨询卖这个抗体的公司。

对于转化细胞来说，可在生长至完全汇合后进行传代，细胞生长大都不宜过密，对于存在接触抑制的细胞，在汇合度80%可传代，否则易引起细胞老化，或生长缓慢需要较长时间才能恢复正常。

4%多聚甲醛固定，用防淬灭的固定剂封片，然后直接去荧光显微镜下观察拍照就行。

那就应该及时传代来保持细胞状态了。然后传代的时候多次轻柔吹打消化，用8字法等方法摇匀，传代之后就不要随便移动培养皿了。

用于动物体内实验的腺相关病毒(Adeno-associated virus,AAV) ，是否需要纯化与浓缩?

腺相关病毒(Adeno-associated virus, AAV)进入宿主细胞之后，其基因组会整合到宿主细胞基因组中吗?

常用的病毒滴度的单位有哪些呢?

这个一般就是在mirbase上查，ncbi上也能看到大部分信息，但是没mirbase全。我记得genecard上也能看人的miRNA来着。

应该得先永生化，转SV40T跟htert，永生化成功之后再慢病毒过表达目的基因。这个还得选好不同的筛选抗性或荧光基因，感觉还挺复杂的。

这个用RNA外切酶，RNase R去线性化就行了，我看别的实验室就是这么做的，应该是个比较常用的方法

体外细胞实验为什么很少见到有用腺相关病毒（Adeno-associated virus, AAV）病毒做的呢？

腺相关病毒（Adeno-associated virus, AAV）是如何达到体内特异性表达的呢？

腺相关病毒（Adeno-associated virus, AAV）的安全性怎么样？

用于动物注射的siRNA需要做哪种修饰呢？

这应该是不太正常呢，我们测量的基本是几万到几百万的都有，可能是质粒没转染进去，细胞的状态差会影响转染效率，也有可能是实验检测试剂盒的问题，或者检测机器没有设置好，需要逐一排查一下。

必须要转内参的，这个内参是为了平衡细胞数量、转染效率等误差，这个实验中，内参质粒是phRL-TK

请问3代的慢病毒载体可以使用2代的慢病毒包装系统来包装吗？

加入慢病毒病毒后，细胞死亡很厉害，该如何处理？

为什么过表达基因慢病毒的荧光比对照的荧光弱？

慢病毒感染细胞后，细胞死亡的很多，还出现黑点是什么原因呢？

AAV注射小鼠后有20%左右的死亡，应该从哪些地方分析原因？

慢病毒感染细胞做过表达，用puromycin筛选7天死亡比较多，是跟我筛选时间过长有关吗？应该筛选多久比较好呢？