落落

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最后活动于 2023-10-26

因为血清中含有大量的蛋白质,带负电的蛋白质可能干扰阳离子脂质体/阳离子聚合物对核酸的吸附,最终影响转染效率。

建议两个慢病毒携带不同的抗性,先转cas9慢病毒,筛好稳转株之后再转gRNA慢病毒,再用另一种药物筛稳转就可以了。

GFP(代表绿色荧光蛋白)是一种在暴露于蓝光时表现出明亮的绿色荧光的蛋白质,而EGFP(代表增强型绿色荧光蛋白)表现出比GFP更强的荧光。 此外,GFP和EGFP之间的另一个重要区别是GFP是从水母Aequorea victoria分离出来的野生型蛋白质。但是,EGFP是原始野生型的工程变体。GFP和EGFP是两种类型的蛋白质,用作内部发色团。它们不需要任何辅助酶/底物,辅因子或基因产物来展示其颜色。因此,两者都被用作分子生物学中基因表达的报告者。一般认为EGFP的荧光更强些。

这是因为saCas9识别的PAM序列要比spCas9的PAM序列长,在基因组中出现的概率更低,相比于spCas9脱靶率要低,其gRNA设计也相对更困难。

可以将两个基因分别包成两个过表达慢病毒(Lentivirus)进行先后的分别感染与筛选,给两个慢病毒分别带上不同的抗性基因和荧光,先感染一个病毒进行筛选,成功之后,再进行下一个基因的感染与筛选,一般就可获得同时过表达两个基因的稳转细胞株。

不一定有效果。 首先,需要看大鼠干扰靶点序列是否与小鼠基因CDS序列完全匹配,不能完全匹配则干扰效果不佳或者无效果;其次,即使序列完全匹配,大鼠干扰靶点序列由于未经blast,在小鼠中可能会有脱靶效应。

1)LncRNA大部分是定位于细胞核内, RNAi 机制在细胞质效率远高于细胞核,所以实验前最好弄清楚LncRNA的定位,如果定位于核内就不建议选择siRNA,可以考虑设计ASO进行干扰;

2)LncRNA 是具有高度二级结构的RNA,可能影响siRNA 与 lncRNA 的结合;
3)LncRNA 与 DNA 及蛋白形成复合体,同样阻碍 RISC 复合体与 lncRNA 的结合效率;
4)LncRNA 在多种类型细胞或模

从描述来看,就是试剂对照组也出现了显著的下调,这样来看,你这次实验的数据是没有意义的。试剂对照组的结果表明本次实验操作或者转染试剂使用量对细胞的转录产生了影响,因此也无法证明实验组的下调是siRNA导致的特异性下调,所以建议先摸索试剂最佳用量、排除实验操作问题。

一般来说可分析的干扰实验结果应该是试剂对照组和NC组较空白对照均无显著性变化,前者无变化证明实验设计和操作无误,后者则进一步证明是特异性siRNA引起的特异性下调结果,这样实验组的数据方为有效数据,本人经验,仅供参考。

做过表达,qPCR显示有过表达,但是WB没有过表达是为什么啊?

干扰慢病毒(lentivirus)是根据基因的所有转录本的共同CDS设计的,做完干扰后想做个过表达回补实验,怎么做才能让外源过表达的基因不受干扰序列的影响呢?

我看做miRNA和靶基因结合还可以用自由能预测,如果targetscan预测分数很低但是自由能预测结果还不错,以哪个为准呢?

我买了一个Cas9的慢病毒(lentivirus)穿梭质粒,打算自己包慢病毒,可以把这个质粒直接转到细胞里先验证下切割活性吗?

可能原因比较多:1.病毒包装不成功;2.滴度不够,可能病毒尚未从细胞中释放出来,可以试着将细胞裂解一下然后收集病毒;3.调整MOI根据细胞类型适合调整加入的病毒量等
荧光只是观察病毒感染效果的一个辅助方式,荧光强弱不代表目的基因的表达量高低,基因表达水平需要通过基因表达水平需要通过qPCR或者WB来鉴定。

一般是通过microRNA靶基因的表达情况判断microRNA的干扰是否有效。一般采用antago或sponge进行microRNA干扰,是利用antago或sponge与靶基因mRNA竞争性去结合microRNA,从而达到干扰microRNA功能的作用,microRNA并不会降解且仍存在于细胞中,所以用qPCR检测其表达量可能不会有变化,无法判断干扰效果。

腹腔注射小鼠肠道AAV用量一般在150-200ul/只,但是感染效果不是特别理想,如果实验室有条件建议用肠系膜动脉注射,具体操作和用量可以参考这篇文章→

可以同时感染,如果腺病毒毒性比较小,两个可以都用moi=100感染。如果细胞比较敏感,也可以考虑moi减半再复感染。

可以考虑中间用linker链接,在一定程度上可以分离两个连接的蛋白,避免它们相互作用,进而避免影响融合蛋白的稳定性或者生物活性。

这个最好能结合原始数据分析。你有做单转转染试剂的对照组吗?看看是不是转染试剂的影响。也有可能是目的细胞比较敏感,可以换个细胞试试,如果还是出现这种情况有可能是阴性对照比较意外地结合上,需要换个si-NC。

干扰NC 对照序列只是一段无义序列,理论上不会靶向任何基因,可用作通用对照,一般可以满足大部分干扰实验的要求。乱序对照是将目的干扰序列打乱而得到的,即一条目的序列对应一条乱序对照,因而又称为严格对照。

可以,但效果一般没有Luc好。类似ZsGreen、GFP或RFP这类荧光蛋白通过激发光激发荧光基团到达高能量状态,而后产生发射光。虽然荧光信号远远强于生物发光,但非特异性荧光产生的背景噪音使其信噪比远远低于Luc的生物发光。 通俗来讲就是ZsGreen做活体成像最后的结果会产生比较高的背景,也就是生物自发荧光与ZsGreen荧光信号混杂,导致灵敏性低。活体成像首选是Luc。

用CRISPR/Cas9做基因敲除,定制的慢病毒(lentivirus),分了两个载体,一个Cas9载体和一个gRNA载体。之前用空载慢病毒摸索过目的细胞的最佳moi,是50,两个病毒载体都用moi=50感染目的细胞吗?


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