荧光素一般通过腹腔注射或尾部静脉注射进入小鼠体内的。常用方法是腹腔注射，扩散较慢，开始发光慢，持续发光长。若进行荧光素静脉注射，扩散快，开始发光快，但发光持续时间很短。大部分文献中，荧光素的浓度是150mg/kg。20g的小鼠约需3mg的荧光素（具体可参考相应文献）。

可以，磷酸化一般发生在丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸这三种氨基酸上，一般突变成其他氨基酸即可，如果目的蛋白的磷酸化位点突变有文献支撑更好。

如果细胞状态没问题的话，一般对干扰效率没什么影响。

将荧光蛋白与目标蛋白进行融合表达，直接地追踪目标蛋白或是定位目标蛋白，多聚体可能会影响融合蛋白的生物学功能或定位，建议尽量选择单体。绿色荧光融合目前EGFP应用比较广泛。

用腺相关病毒（adeno-associated virus，AAV）感染心脏，感染完之后还要做组织免疫荧光（红绿光）染其他指标，怎么选择AAV的荧光呢？

想请教下做慢病毒（LV，lentivirus）过表达WB一直没有条带是什么原因？看荧光感染效率有80%以上，qPCR结果也不错，感染72h后做WB，目的抗体检测没有条带，空白、对照和目的组都没有，是上样量太少了吗？

最好是带特异性启动子，AAV病毒（Adeno-associated virus）选择尾静脉注射，如果是广谱启动子一般也会感染到其他脏器。目前用得比较多的肝脏特异性启动子是TBG，可以试试

没有要求，一般建议结合自己的实验进行选择。比如说如果后续要做免疫荧光这类的实验，或者要共转其他带荧光的质粒，前期选择荧光标签就要考虑避开

从floxp小鼠分离出来的原代细胞，用携带Cre的腺病毒（Adenovirus，AdV）进行感染，但敲除结果非常不理想且不稳定，这种结果的可能原因和解决方案有哪些？

请问不同网站启动子序列差很多正常吗？我根据网上教程用ncbi和ucsc都试了下，发现两个序列差了快400bp，ncbi是序列往前推了2000bp，ucsc是取了上游2000bp。

我想研究一个基因，但在ncbi上查发现有好多转录本，怎么选择研究的转录本呢？

感染了慢病毒（Lentivirus，LV）后分选出来培养的细胞中，在后续传代培养过程中新长出来的细胞会有不带荧光的情况吗？如果会有这种情况怎么继续维持阳性率呢？

可以参考贴壁细胞的接种数量做。一般做慢病毒感染的细胞接种初始数量可以根据细胞的生长速度决定，以48-72h内达到传代标准接种，理论上来说到48h后基本就可以用药进行筛选了，个人经验，仅供参考。

如果前期实验有出现过有下调趋势的结果，那最有可能的原因是目的蛋白本底比较高，mRNA的翻译效率比较好，这个程度的mRNA水平敲低映射到蛋白水平不明显，WB技术最终的定量本身就存在一定的误差，所以变化可能不明显。

可以和没有感染病毒的细胞对比下排除下自发荧光。不是自发荧光的话，亮的和淡的都是感染上了的，淡的就是进入细胞的慢病毒比较少，可以再摸索下合适的moi哦。

不建议这么做哦，完全能匹配上不代表干扰效果一样，最好重新设计siRNA。

可以是可以，小鼠系统注射一般是注射5-20nmol/20g，一周注射2-3次，连续2-4周，第一次注射后2-4周检测。不过还是建议用病毒哦，siRNA在体内不太稳定，容易分解。如果有现成的干扰腺病毒（Adenovirus，ADV）一周就可以检测了，腺相关病毒（adeno-associated virus，AAV）需要注射3周后检测。

可以用培养基中和。收集全部细胞到离心管中，1500rmp离心3min，弃上清用完全培养基重悬继续培养，状态不好的细胞在培养的过程中会死亡脱落，换液的时候可以去掉。

基于Cre-loxp系统的DIO系统和FLEX系统有什么区别，如果有组织特异性Cre鼠，想在这一组织上特异性表达某个基因，是用哪一种？

做敲低，用siRNA转染细胞有70%-80%的敲低效率，为什么同样的靶点做成shRNA慢病毒（Lentivirus）就检测不到干扰效果呢？

因为血清中含有大量的蛋白质，带负电的蛋白质可能干扰阳离子脂质体/阳离子聚合物对核酸的吸附，最终影响转染效率。

建议两个慢病毒携带不同的抗性，先转cas9慢病毒，筛好稳转株之后再转gRNA慢病毒，再用另一种药物筛稳转就可以了。

GFP（代表绿色荧光蛋白）是一种在暴露于蓝光时表现出明亮的绿色荧光的蛋白质，而EGFP（代表增强型绿色荧光蛋白）表现出比GFP更强的荧光。 此外，GFP和EGFP之间的另一个重要区别是GFP是从水母Aequorea victoria分离出来的野生型蛋白质。但是，EGFP是原始野生型的工程变体。GFP和EGFP是两种类型的蛋白质，用作内部发色团。它们不需要任何辅助酶/底物，辅因子或基因产物来展示其颜色。因此，两者都被用作分子生物学中基因表达的报告者。一般认为EGFP的荧光更强些。

这是因为saCas9识别的PAM序列要比spCas9的PAM序列长，在基因组中出现的概率更低，相比于spCas9脱靶率要低，其gRNA设计也相对更困难。