我的基因和GFP 融合，用慢病毒感染细胞后荧光比较弱，可能是哪些因素造成的呀？

为什么过表达慢病毒质粒转染 293T 的荧光很强而用慢病毒感染 293T 的荧光反而弱呢？

SaCas9 和 spCas9 区别， 我们的慢病毒， 腺病毒， 腺相关病毒分别用的是哪种 Cas9？

为什么做WB用标签抗体检测有过表达，但是用目的抗体检测没有过表达？

为什么我的片子在观察荧光时要曝光很长时间才能观察到荧光？

我用 siRNA 做干扰，验证了明明有效果，为什么把这个序列包装成慢病毒做干扰效果不好了呢？

重组病毒滴度有多种单位表示，这些不同表示形式主要是因为不同的测定方法以及过去的使用习惯造成的。1. TU/mL是Transduction Unit/mL的缩写，转导单位，多用于慢病毒载体;2. PFU/mL是Plaque Forming Unit/mL的缩写，指噬菌斑形成单位，常用于腺病毒载体;3. VG/mL是Vector Genomes/mL的缩写，是指每mL病毒液中含有的基因组拷贝总数，一般用于表示腺相关病毒(Adeno-associated virus, AAV)载体的滴度

野生型腺相关病毒感染人体细胞后，由于其rep基因、ITR序列结构和宿主基因组的相互作用，可能倾向整合到19号染色体短臂上的AAVS1位点，在小鼠中是倾向整合到ROSA2.6基因位点，而改造过的重组型腺相关病毒rAAV，由于基因组上已经去除了rep和cap基因，因此失去了整合到宿主基因组的特性。rAAV在体内组织，特别是在肌肉组织中，在宿主基因组染色体以外以附加子(episome)的双链DNA形式存在，持续稳定表达目的基因

 一般来说是需要的，细胞裂解液中含有大量的病毒衣壳蛋白、宿主细胞碎片、血清和细胞毒素等多种成分，这些杂质如果直接被注入动物体内，可能会导致宿主的免疫反应。如果病毒滴度不高，达不到感染特定靶器官组织的目的。因此AAV载体经过纯化和浓缩之后，有利于后续动物体内实验顺利进行。

我用腺病毒感染前一天提取的原代巨噬细胞，细胞状态那时候不错，感染时用的无血清无双抗的培养基，感染后16h后换的液，感染后细胞死了很多，而且荧光效率也低，用的MOI是已经预实验摸索过的，为什么出现这种情况呢？

我的目的细胞是人髓核细胞，请问有人做过吗？用腺病毒还是慢病毒感染啊？

我想做双荧光素酶实验，一定要用293t细胞来做吗？

用于不同血清型的AAV具有不同的组织嗜好性，可以利用特异性血清型及特异性启动子的AAV来达到在特定组织细胞表达的目的。此外，选择局部注射方式也可以在一定程度达到特定组织表达的目的。

目前还未发现AAV有致病性，实验用的AAV载体的包装过程中，辅助质粒之间不具有同源性序列，理论上这种AAV不具有复制能力。并且AAV的免疫原性非常低，目前已有AAV用于临床疾病的治疗，因此AAV的安全性是非常高的，可以安全放心的用于实验研究。

因为AAV是单链DNA，感染细胞后需要先变为双链才能进行转录翻译，因此存在表达延迟的可能。另外，细胞在体外生长速度较体内快，AAV感染细胞后随着细胞的快速分裂不断稀释，进一步导致了表达水平降低。而在体内实验中，AAV感染的组织细胞增殖速度通常不会那么快，且AAV不同血清型和启动子配合使用，更适合用于体内实验。

有些细胞对DMSO挺敏感的，那种复苏的时候就去除比较好。Siha感觉还挺好养的，可以直接培养，第二天再换液。

一般可以使用甲氧基（2'-Ome）和胆固醇(5'-cholestrol)双修饰的siRNA，进行体内注射。

感觉这两个都可以，不过都是预测，能不能结合还是得做实验。种子区预测和自由能预测原理不一样，种子区预测是看的miRNA那一段种子区和靶基因是不是完全匹配，有的网站还会评估一下整条序列匹配程度，自由能要看整条miRNA的序列互补匹配程度跟复合结构的自由能

做启动子和转录因子的双荧光素酶实验，必须要转内参质粒吗？内参质粒是哪个呢？

我自己做启动子和转录因子的双荧光素酶实验，检测到的值都只有几十，这正常吗？

我要做敲除，但是基因长度有7566bp，这么长做敲除没问题吧？

因为慢病毒对细胞有一定的毒性作用，出现这种情况需要调整并降低感染的MOI值，并且在感染后4小时、8 小时、12 小时对细胞进行观察，若发现细胞状态变差时，则需要立刻对细胞进行换液操作，使用新鲜的完全培养液替换病毒感染培养液。

可以的，第3代慢病毒的目的质粒可以被第2和第3代慢病毒系统包装，汉恒的慢病毒系统是第2代的。

这是不同的血清型，AAV结构是rep+capsid+两端的ITR，血清型不同就是因为后面的capsid不一样。AAV2/*意思是rep都是2型，因为2型是最早发现的，其他血清型是在2型的capsid的基础上进行改良，capsid的不同使得血清型不同。

这个一般是点突变就可以，也可以做成全突变的。

注射了对照病毒的也有死亡吗？看是否是因为注射进去表达的基因对小鼠有影响。还有就是如果是原位注射，看是否是因为实验操作导致小鼠有感染了，或者手术对小鼠的活力影响比较大。

1.病毒滴度。滴度不高，感染效率也会比较低2.目的基因大小。目的基因太大会影响滴度，也会影响荧光的表达3.AAV储存时间过久会导致滴度降低，所以建议病毒到货后尽快使用，不要反复冻融，短时间内使用就放4度冰箱就好。收到后也尽量分装好。

如果要检测您目的基因的过表达效果，是得取出来做QPCR检测和western blot的。

一般来说，筛选一周左右是正常时间，有可能是Puro的浓度太高导致的，在正式实验之前做个预实验确定一下puro的最适筛选浓度，它指的是一周内能杀死所有对照细胞的最低浓度。

可以的，这个方式可以判断您AAV对您目标组织的感染效率，所以是可以实现的。