刚开始做双荧光素酶报告法验证miRNA的靶基因,疑问如下
刚开始做双荧光素酶报告法验证miRNA的靶基因,疑问如下
By MR. 司
at 2014-12-26
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刚开始做双荧光素酶报告法验证miRNA的靶基因,疑问如下
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1 个回复 | 最后更新于 2014-12-26
目前看到的文献中的miRNA的表达载体一般有这样几种形式:1,pri-miRNA的部分序列,400BP左右,构建到含有CMV等启动子的载体上,不需要起始序列、终止序列、AAAAA等原件(当然酶切位点保护碱基啥的要有,除非你先整到T载体上),直接NCBI找到该miRNA的序列然后左右两翼扩展一下,总长达到400bp左右即可,以DNA为模版扩增。2,pre-miRNA,大约70多bp,因为这个要形成颈环结构,所以必须构建到含有H1或U6启动子的载体上,因为长度不大,所以可直接合成正反义两条链(有酶切位点,直接露出黏性末端即可,这样以后就不用再酶切了),体外退火成双链,然后连载体。3,成熟双链miRNA,直接按照miRNA的成熟序列(22bp左右)合成正反义两条链,体外退火成双链,连载体或者直接脂质体转染或者显微注射即可。